שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
תאי מולר הם תאי גליה העיקריים של הרשתית. קצה רגליהם יוצרות את הגבולות של הרשתית בקרומים החיצוניים ופנימיים הגבלה (ILM), ובשיתוף עם האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל הם מקימים את מחסום הדם-רשתית (BRB). BRB מגביל תחבורה מהותית בין זרם הדם והרשתית תוך ILM פועל כקרום במרתף שמגדיר בהיסטולוגיה גבול בין הרשתית וזגוגית החלל. תיוג תאי מולר הוא רלוונטי במיוחד כדי ללמוד את מצבו הפיזי של המחסומים ברשתית, תאים אלה הם חלק בלתי נפרד מBRB וILM. שני BRB וILM לעתים קרובות שינו במחלת רשתית ואחראי לתסמיני מחלה.
ישנן מספר שיטות מבוססות היטב ללמוד על שלמות BRB, כגון assay הכחול אוונס או אנגיוגרפיה והעמסת. עם זאת שיטות אלה אינן מספקים מידע על המידה של t חדירות BRBo מולקולות גדולות יותר, בטווח ננומטר. יתר על כן, הם אינם מספקים מידע על מצבם של חסמים אחרים ברשתית כגון ILM. ללמוד חדירות BRB צד ILM רשתית, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שמספקת מידע על חדירות של BRB למולקולות גדולות יותר תוך ציון המצב של חלבוני ILM ומטריצת חוץ-תאית במצבי מחלה. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטני אור, אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהל לתוך הזגוגית כאשר ILM הוא שלם (כלומר, ברשתית wild-type). יש ShH10 כמיהות חזקות לתאי גלייה וסלקטיבי תווית גליה מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה. ShH10 מספק מסירת גן יעילה יותר ברשתית שבו ILM נפגעת. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם ניתוח אימונוהיסטוכימיה והדם-DNA לשפוך אור על מצבם של חסמי רשתית במחלה.
Introduction
תאי מולר הם המרכיב העיקרי גליה של הרשתית. מורפולוגית, הם משתרעים על פני רשתית רדיאלית וendfeet, במגע עם הזגוגית, להתמודד ILM ורכיבים סודיים של זה האחרון. ILM הוא קרום במרתף מורכב מעשרה חלבונים שונים תאיים מטריצה (laminin, Agrin, perlecan, nidogen, קולגן וכמה proteoglycans סולפט הפרין). במהלך פיתוח, הנוכחות שלה היא הכרחית עבור histogenesis רשתית, ניווט של אקסונים האופטיים, והישרדות של תאי הגנגליון 1-3. עם זאת, ILM הוא בלתי חיוני ברשתית מבוגרת וניתן להסיר בניתוח בפתולוגיות מסוימות מבלי לגרום לניזק לרשתית 4. בריפוי גנטי, קרום זה הופך להיות מכשול פיזי לתמרה יעילה של הרשתית באמצעות AAVs על ידי הזרקת תוך 5.
דרך arborization הנרחב של התהליכים שלהם, תאי מולר לספק suppo התזונתי והרגולציהrt לשני נוירונים ברשתית ותאי כלי דם. תאי מולר מעורבים גם בוויסות של הומאוסטזיס ברשתית, בהקמה והתחזוקה של BRB 6. צמתים הדוקים בין תאי האנדותל נימי רשתית, תאי מולר, האסטרוציטים וpericytes יוצרים BRB. BRB מונע מחומרים מסוימים מלהיכנס למחלות רבות כמו retina.In רטינופתיה סוכרתית, חסימת וריד רשתית ומחלות בדרכי הנשימה, חוסר חמצן של הרשתית גורם לדליפה באמצעות 7-9 BRB. קרע זה קשור לעלייה בחדירות כלי דם שמובילה לבצקת vasogenic, היפרדות רשתית ופגיעה ברשתית.
תאי מולר קשורים באופן הדוק עם כלי דם והקרום במרתף, ששיחקו תפקיד חשוב בשתי יושרת BRB וILM. כתוצאה מכך, תיוג תאי גליה מולר הוא רלוונטי במיוחד למחקר של המצב הפיזי של מחסומי רשתית אלה.
קלאסיברית, חדירות BRB נמדדות באמצעות assay הכחול אוונס המורכב מהזרקה המערכתית של צבע הכחול אוונס, אשר נקשר אינה קוולנטית לאלבומין פלזמה. assay זה מודד את דליפת אלבומין (חלבון בגודל ביניים, ~ 66 KDA) מכלי דם לתוך הרשתית (ראה פרוטוקולי סעיף 5) 10. לחלופין, הדליפה של כלי הדם ניתן דמיינה ידי אנגיוגרפיה הקרינה רשתית המעידה על דליפה של העמסה (מולקולה קטנה, ~ 359 Da; ראה סעיף פרוטוקולים 6) 11. עם זאת, בשתי השיטות מאפשרות הערכה של חדירות BRB למולקולות קטנות וחלבונים אבל הם לא מספקים מידע על יושר ILM.
לפיכך, ללמוד חדירות BRB, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שנותנת מידע על חדירות BRB למולקולות גדולות יותר (חלקיקי AAV למשל,, 25 בקוטר ננומטר). ואכן, השיטה שלנו יכולה לזהות נוכחות של transgene AAV בדם, שהייתי מציעה ש~ חלקיקי 25 ננומטר קוטר הייתתוכל לחדור לזרם הדם. שיטה זו גם מספקת מידע על המבנה של ILM וחלבוני מטריצה תאיים במצבים פתולוגיים. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. הזריק Subretinally, יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטניים אור ואפיתל הפיגמנט ברשתית 12 אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהלים לתוך הזגוגית ברשתית wild-type עם ILM שלם 5,13. ShH10 היא גרסת AAV שתוכנן במיוחד כדי למקד את תאי גלייה על נוירונים 14,15. ShH10 סלקטיבי תוויות בתאי מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה עם התייעלות ברשתית עם מחסומים נפרצו 16. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם immuhistochemistry ובדיקות הדם-DNA לספק מידע על מצבם של חסמי רשתית ומעורבותם במחלה (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB מסדיר את חילופי מולקולות בין הדם לרשתית. התמוטטותה קשורה למחלות שונות כגון רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD). לאחרונה הראו כי בעכבר דיסטרופין נוק-אאוט, אשר מציג BRB החדיר, הרשתית הופכת להיות יותר מתירנית למסירת הגן בתיווכו של וקטורי adeno הקשורים ויראל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
