Ved hjelp adenoassosiert virus som et verktøy for å studere Retinal Barrierer i Disease
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Muller-celler er de viktigste gliaceller i netthinnen. Deres slutt føtter danner grensene for netthinnen på det ytre og indre begrensende membraner (ILM), og i forbindelse med astrocytter pericytes og endotelceller de etablere blod-retinal barriere (BRB). BRB begrenser materialtransport mellom blodet og retina mens ILM fungerer som en basalmembran som definerer histologisk grensen mellom netthinnen og i glasslegemet. Merking Müller cellene er spesielt relevant å studere den fysiske tilstanden til netthinnens barrierer, som disse cellene er en integrert del av BRB og ILM. Både BRB og ILM er ofte endret på netthinnesykdom, og er ansvarlig for sykdomssymptomer.
Det er flere godt etablerte metoder for å studere integriteten til BRB, slik som Evans blue assay eller fluoresceinangiografi. Men disse metodene ikke gir informasjon om omfanget av BRB permeabilitet to større molekyler, i nanometerområdet. Dessuten trenger de ikke gi informasjon om tilstanden i andre retinal barrierer som ILM. Å studere BRB permeabilitet sammen retinal ILM, brukte vi en AAV basert metode som gir informasjon om permeabilitet av BRB til større molekyler mens indikerer tilstanden til ILM og ekstracellulære matrix proteiner i sykdomstilstander. To AAV varianter er nyttige for en slik studie: AAV5 og ShH10. AAV5 har en naturlig tropisme for fotoreseptorer, men det kan ikke komme over til den ytre retina når den administreres inn i glasslegemet når ILM er intakt (dvs. i villtype netthinne). ShH10 har en sterk tropisme mot gliacellene og selektivt vil merke Müller gliaceller i både friske og syke netthinne. ShH10 gir mer effektiv genet levering i netthinne der ILM er kompromittert. Disse viral verktøy kombinert med immunhistokjemi og blod-DNA-analyse belyse på staten netthinnens barrierer i sykdom.
Introduction
Müller-celler er hoved glial komponent av netthinnen. Morfologisk, spenner de retina radialt og deres endfeet, i kontakt med glasslegemet, står ILM og hemmelige delene av den sistnevnte. ILM er en basalmembran bestående av om lag ti forskjellige ekstracellulære matrix proteiner (laminin, agrin, perlecan, nidogen, kollagen og flere heparinsulfat proteoglykaner). Under utvikling, er dens tilstedeværelse uunnværlig for retinal histogenesis, navigering av optiske axoner, og overlevelse av ganglion celler 1-3. Imidlertid er ILM uvesentlig i voksen netthinnen og kan fjernes kirurgisk i visse patologiske tilstander uten å forårsake retinal skade 4. I genterapi, blir denne membranen en fysisk barriere for effektiv transduksjon av netthinnen ved hjelp AAVs etter intravitreal injeksjon 5.
Gjennom omfattende arborization av sine prosesser, Müller celler gi ernæringsmessige og regulatoriske support til både retinal nevroner og vaskulære celler. Muller-celler er også involvert i reguleringen av retinal homeostase, i dannelsen og opprettholdelsen av den BRB 6. Tett veikryss mellom netthinnens kapillære endotelceller, Müller celler, astrocytter og pericytes danne BRB. BRB hindrer visse stoffer kommer inn i retina.In mange sykdommer som diabetisk retinopati, retinalveneokklusjon og luftveissykdommer, hypoksi av netthinnen som forårsaker lekkasje gjennom BRB 7-9. Dette brudd er assosiert med en økning i vaskulær permeabilitet som fører til vasogenic ødem, netthinneavløsning og retinal skade.
Müller cellene er tett forbundet med blodårer og basalmembran, som spiller en viktig rolle i både BRB og ILM integritet. Derfor merking Müller gliaceller er særlig relevant for studiet av den fysiske tilstanden til disse retinal barrierer.
Classically, er BRB permeabiliteten målt ved hjelp av Evans blått-analysen består av systemisk injeksjon av Evans blått farvestoff, som bindes ikke-kovalent til plasma-albumin. Denne analysen måler albumin lekkasje (protein av middels størrelse, ~ 66 kDa) fra blodårene i netthinnen (se Protokoller avsnitt 5) 10. Alternativt kan den vaskulær lekkasje bli visualisert ved fluorescens retinal angiografi bevitner for lekkasje av fluorescein (lite molekyl, ~ 359 Da; se Protocols avsnitt 6) 11. Likevel, begge metodene tillate evaluering av BRB permeabilitet til små molekyler og proteiner, men de gir ikke informasjon om ILM integritet.
Derfor, for å studere BRB permeabilitet, brukte vi en AAV basert metode som gir informasjon om BRB permeabilitet til større molekyler (f.eks, AAV partikler, 25 nm diameter). Faktisk kan vår metode påvise tilstedeværelse av AAV transgenet i blodet, noe som kan tyde på at ~ 25 nm diameter partikler wouldvære i stand til å infiltrere inn i blodet. Denne fremgangsmåten tilveiebringer også informasjon om strukturen av ILM og ekstracellulære matriksproteiner i patologiske tilstander. To AAV varianter er nyttige for en slik studie: AAV5 og ShH10. Subretinally injisert, har AAV5 en naturlig tropisme for fotoreseptorer og retinal pigment epitel 12, men det kan ikke komme over til den ytre netthinnen når det gis i glasslegemet i villtype netthinne med intakt ILM 5,13. ShH10 er en AAV variant som har blitt utviklet spesifikt mot gliaceller enn nerveceller 14,15. ShH10 etiketter selektivt Müller celler hos både friske og syke netthinne med økt effektivitet i netthinne med kompromitterte barrierer 16. Disse viral verktøy kombinert med immuhistochemistry og blod-DNA-analyse gir informasjon om tilstanden i netthinnens barrierer og deres engasjement i sykdom (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den BRB regulerer utveksling av molekyler mellom blod og retina. Dens sammenbrudd er assosiert med ulike sykdommer som diabetisk retinopati eller aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har nylig viste at i en dystrophin knock-out mus, som viser gjennomtrengelig BRB, blir mer ettergivende til genet levering mediert av adenoassosiert virale vektorer (AAV) netthinnen. Imidlertid, til tross BRB permeabilitet AAV partikler injisert Intraokulært forbli begrenset til det okulære rommet i denne modellen. Våre resultater…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
