Genetisk Barcoding med fluorescerande proteiner för Multiplexade Applications

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Tekniker som fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi och flödescytometri, alla förlitar sig på fluorescens, en egenskap utnyttjas i stor utsträckning i biokemiska, biomedicinska och kemiska tillämpningar. Fluorescens, vare inneboende eller genom märkning, har utnyttjats för analys av proteinuttrycksmönster och profiler, cell öde, proteininteraktioner och biologiska funktioner ^1-9, och genom fluorescens / Förster resonans energiöverföring för detektion av biomolekyler interaktioner och konformationsförändringar ^10-13. Eftersom isoleringen av Aequorea victoria grönt fluorescerande protein (GFP) ^14, upptäckten av ytterligare naturligt förekommande fluorescerande proteiner från andra nässeldjur, särskilt koraller, till stor del har ökat antalet befintliga fluorescerande proteiner med urskiljbara excitation / emissionsspektra. Dessa, tillsammans med införandet av mutationer i sina gener ^15-19, have utökas ytterligare möjligheter, få en verklig palett av fluorescerande proteiner tillgängliga för forskare som utnyttjar mikroskopi, flödescytometri och andra fluorescensbaserade teknologier för sin forskning.

Parallellt, även oberoende, utvecklingen av retrovirala teknik har drastiskt lättat stabilt uttryck av ektopisk genetisk information i däggdjursceller ^20-23. Det är därför inte förvånande att denna teknik har använts för att överföra gener av fluorescerande proteiner i ett brett antal celltyper och vävnader ^24-28 eller för produktion av transgena djur ^29-31. Efter naturen av retrovirus är den genetiska informationen av den ektopiska fluorescerande proteinet introducerades inom genomet hos cellen ³² och cellen blir fluorescerande 'för ever'. Denna fastighet har tillåtit spårning av cell öde, eller av en enda cell inom en population av celler. Den nu fluorescerande cell har sålunda acquiröd egen Biosignature och kan definieras som barcoded. Dess unika Biosignature identifierar den från andra celler, och viktigare, skiljer den från celler genmanipulerade för att uttrycka olika fluorescerande proteiner med urskiljbara absorption / emissionsspektra. Biologiska applikationer såsom spårning av omprogrammering faktorer mot pluripotens ^33, analysen av subnukleära faktorer för att klarlägga nukleolär lokalisering ^34, byggandet av fluorescerande reporterplasmider för transkriptions studier ³⁵ eller den genetiska märkning av nervceller för studier av neuronala nätverksarkitektur ³⁶ , är bara fyra exempel på de många som har utnyttjat olika fluorescerande proteingener för samma experimentuppställning.

Flödescytometri har i stort sett utnyttjats för analys av biologiska processer på en enda cell nivå, såsom genuttryck, cellcykeln, apoptos, och signalering genom fosforyl-ation ^37-43 .Den stabilt uttryck av fluorescerande protein gener i däggdjursceller har förbättrats ytterligare nyttan av flödescytometri för cellanalys ^38,44 och ligand-receptorinteraktioner ^45. Förbättrade funktioner har tillåtit flödescytometri för att bli en allmänt utnyttjad metod för hög genomströmning och hög halt screening ^46. Trots det nu utökat antalet fluorometrar och robotteknik som par plattläsarsystem, bildbehandling och kan flödescytometri, det verkar finnas en brist i experimentell design som kan utnyttja och montera dessa förbättrade tekniska möjligheter.

Snabba, tillförlitliga, enkla och robusta cellbaserade metoder drastiskt behövs för multiplexerade applikationer som ytterligare förstärker hög genomströmningskapacitet. Detta gäller särskilt inom området läkemedelsutveckling där ingenjörs cellbaserade analyser i en multiplex-format kan öka kraften i high-throughput screening ^39,47-50 </sup>. Multiplexing, eftersom det tillåter samtidiga analyser i ett prov, förstärker ytterligare hög kapacitet kapacitet ^51-54. Fluorescerande genetisk streckkodning gör inte bara för eleganta multiplexering, men också, en gång konstruerad, kringgår behovet av tidskrävande protokoll, minskar kostnaderna tillsammans med antikroppar, pärlor och fläckar ^39,52,55, och kan minska antalet skärmar som krävs för hög- genomströmning applikationer. Vi har nyligen beskrivit hur retroviral teknik kan förbättra multiplexering genom fluorescerande genetisk barcoding för biologiska tillämpningar, genom att uttrycka en analys tidigare utvecklat för att övervaka HIV-1 proteas aktivitet ^56,57 med olika kliniskt vanligaste varianterna ^58. Metodiken förklaras på ett mer beskrivande sätt med fokus på hur man väljer och förstärker genetiskt fluorescerande streckkod celler och hur man producerar paneler av klonpopulationer som uttrycker olika fluorescerande proteiner och / eller annan fluorescens intensittalet. Paneler av cellpopulationer urskiljbara baserat på deras fluorescerande egenskaper förbättrar multiplexerade kapacitet, som kan utnyttjas ytterligare i kombination med cellbaserade analyser som tar itu olika biologiska frågor. Protokollet beskriver också hur man konstruera en panel av streckkodade celler som bär en av cellbaserade analyser som tidigare utvecklats i laboratoriet, som exempelvis ^59. Detta protokoll är således inte avsedd att visa den väletablerade retroviral / lentiviral teknik för genetisk överföring, värdet av fluorescerande proteiner eller tillämpningar av flödescytometri ^60,48 utan snarare att visa att öka kraften i att kombinera tre för multiplexerade applikationer.

Protocol

1. Beredning av däggdjursceller, Viral Produktion och transduktion för genetisk Barcoding Plate 2,5 x 10 6 vidhäftande celler i en 10 cm platta (eller omkring 50 till 60% konfluens) en dag före transfektion i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt kalvserum (FCS). För retroviral produktionsemballage cellinje val som Phoenix-GP (en slags gåva från Gary Nolan, Stanford University). OBS: Den packande cellinjen uttrycker stabilt Gag och Pol proteiner för retroviral par…

Representative Results

Multiplexing fluorescerande genetiskt barcoded celler i syfte att biologiska tillämpningar kan endast uppnås när enskilda klon populationer har genererats. Multiplexing är mest effektiv när Barcoded populationer har tydliga distinkta fluorescerande egenskaper med minimal spektral överlappning. Exemplet som visas i figur 1 med klonala populationer av däggdjurs SupT1 celler illustrerar att streckkodade celler med mCherry och cyano fluorescerande protein (GFP) kan lätt analyseras samtidigt utan att…

Discussion

Här två väletablerade rutiner har kombinerats; genteknik genom retroviral teknik och detektion av fluorescerande proteiner utnyttjar flödescytometri. Fluorescerande proteinbaserad genetisk streckkodning för framställning av unika cellinjer tillhandahåller en robust och enkelt sätt för multiplexerade applikationer. Generera genetiskt manipulerade streckkodade celler genom retroviral teknik, är initialt en lång process, men gör att man kan få, när detta upprättats, en pålitlig och stabil källa till cellma…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10mL syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter	pall corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells