작은 볼륨 생물 검정은 물 - 펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정을 사용하여 세균 / 식물 플랑크톤의 공동 문화를 평가하는
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
배양 실험 1-7에 걸쳐 서브 샘플링 될 수 있도록 미세 조류의 실험 조작을위한 종래의 방법은 대량 배양 (5 L 내지 20 ml)에 사용했다. 대량의 서브 샘플링 다양한 이유로 문제가 될 수있다 : 1)는 총 부피와 표면적의 변화 원인은 다음 실험 기간 동안 배양 체적비; 2) 의사 복제 (즉, 동일한 치료 플라스크 8에서 샘플)는 종종 오히려 진정한 복제물 (복제 치료에서 즉, 샘플링)보다 채용을 복제; 3) 실험 기간은 총 부피에 의해 제한된다; 4) 배양 무균 또는 일반적인 세균 미생물 오염은 일반적으로 서브 샘플링 동안 발생 장기 실험 동안 유지하기 어렵다.
미세 적정 플레이트의 사용은 최대 48 내의 별도의 처리 1 ㎖의 각각의 배양에 사용되는 복제 볼륨을 가능12.65 X 8.5 X 2.2 cm 판함으로써 실험 볼륨을 감소하고 치료를 서브 샘플링하지 않고 광범위한 복제를 허용. 9-11 스크리닝 세균성 조류 공동 배양, 조류 생리 테스트 및 독소 : 또한,이 기술은 실험을 포함한 다양한 포맷에 맞게 수정 될 수있다. 조류, 박테리아 및 / 또는 공동 문화와 개인 우물로 제한 등 다양한 실험 절차에 대한 샘플링,하지만 할 수 있습니다 WATER-펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정, 현미경, 세균 집락 형성 단위 (CFU) 수와는 유동 세포 계측법. 마이크로 타이 터 플레이트 포맷 WATER-PAM 형광 측정의 조합은 광 화학적 수율 및 샘플, 높은 재현성과 낮은 가변성과 다른 광 화학적 파라미터의 다수의 신속한 측정이 가능하며 실험의 과정 속에 든 대형 유리 병 또는 원추형 플라스크를 서브 샘플링 많은 함정을 피할 .
Introduction
식물 플랑크톤의 생리는 전통적으로 원뿔 플라스크에 20 ㎖에서 carboys 1-7에서 5 L에 이르는 메조 규모의 실험에서 연구되어왔다. 각 시점에 대한 복제 샘플을 희생하는 것이 관리하기 어려운 실험 장치를 만들어으로이 실험 규모는 실험 모니터링을위한 서브 샘플링을 필요로한다.
줄이거 나 대량의 서브 샘플링 및 의사 – 복제의 제한을 제거한다 조류 생리학 실험 실험 용적을 소형화하여 일주 동일한 인큐베이터 공간을 사용하면서 기능은 독립적 인 실험의 수를 증가시키는. 마이크로 타이 터 플레이트 포맷은 가변 실험적 조건에서 조류를 조작 1ml의 배양 부피를 사용하여 조류 생물 검정을 위해 개발되었다. 실험이 작은 부피 복제물의 수가 증가 될 수 있도록 허용 복제에 의한 샘플 간의 감소 가변성 실험의 재현성을 증가(그림 2) 12 1백40일에 대한 실험 컨트롤 (즉, 무균 조류 배양)를 유지하면서 실험하고, 진정한 복제를 할 수 있습니다.
이 마이크로 타이 터 플레이트 형식은 쉽게 같은 실험 다양한 질문에 대한 적응 : 박테리아가 조류 호스트와 공생 중성 또는 병원성 상호 작용을해야합니까? 조류의 복합 자극의 추가 또는 독성인가? 이들 및 다른 문제는이 새로운 포맷을 사용하여 9-11 빠른 높은 처리량 방법으로 해결할 수있다.
48 웰 마이크로 타이 배양 플레이트는 각 1 ㎖를 잘 단일 시간 시점에서 샘플링 독립적 인 실험 장치가 될 수 있습니다. 다양한 매개 변수를 포함하여 1 ml의 볼륨에서 샘플링, 이에 국한되지 수 있습니다 WATER-펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정 (재료 및 장비 표 참조) 1을 사용 엽록소 형광 및 광 화학적 매개 변수3. WATER-PAM의 형광 측정 조류 13의 실험을 모니터링하는 데 사용할 수있는 신속하고 비 침습적 방법이다. 14, 15 (WATER-PAM 4 ml의 볼륨 – – 2 중간에 희석 문화의 300 μL 150) 그것은 작은 문화 볼륨에서 광합성 효율과 광계 건강을 측정 할 수 있습니다. WATER-PAM의 형광 측정에 더하여,이 설정을 포함한 다른 다양한 파라미터를 측정하는데 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 : 조류 세포 및 조류 세포 형태의 변화에 부착 된 박테리아를 시각화하는 현미경; 단위 (CFU) 수를 형성하는 박테리아 식민지; 및 조류 세포 수 및 식별 주민들을위한 유동 세포 계측법.
Protocol
Representative Results
Discussion
소형 형식으로 조류 성장.
현재 실험에서 복제가 증가 될 수 있도록 마이크로 타이 터 플레이트에서 1ml의 배양 부피 조류 배양의 소형화를 허용한다. 이 녹조류는 실험 내내 건강 보장하는 것이 중요하다; 조류의 영양 요건이 충족 될 수 있도록, 다양한 조류 매체를 평가하기 위해 마이크로 타이 터 플레이트 포맷을 사용하여, 성장 곡선 (도 2)를 수행한다. 또한,이?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
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