परमाणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एकल अणु आसंजन की जांच कर
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
परमाणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी सतहों और इंटरफेस में अणुओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है। Covalently एक AFM टिप पर जोड़े एकल अणुओं की एक विशाल विविधता के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। एक ही समय में AFM टिप टिप AFM से जुड़ी एकल अणुओं का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है जो टिप और सब्सट्रेट के बीच unspecific बातचीत को रोकने के लिए passivated है। विश्लेषण आसंजन बल, आसंजन लंबाई, और कुछ ही देर में प्रस्तुत कर रहे हैं और आगे पढ़ने के लिए बाहरी संदर्भ प्रदान की जाती हैं ठोस सतहों और जैव इंटरफेस पर इन अणुओं की मुक्त ऊर्जा निर्धारित करने के लिए। उदाहरण के अणुओं पाली (अमीनो एसिड) polytyrosine हैं, भ्रष्टाचार बहुलक PI- जी -PS और फॉस्फोलिपिड पोप (1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine)। इन अणुओं सीएच 3 -SAMs जैसे विभिन्न सतहों, हाइड्रोजन समाप्त कर हीरे से desorbed और विभिन्न विलायक शर्तों के तहत लिपिड bilayers समर्थन कर रहे हैं। अंत में,बल स्पेक्ट्रोस्कोपी एकल अणु प्रयोगों के फायदे सही मायने में एक अणु प्रयोग में अध्ययन किया गया है इसका मतलब है अगर तय करने के लिए सहित चर्चा कर रहे हैं।
Introduction
पिछले 30 वर्षों में, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) यह सभी तीन आयामों में आणविक स्थानिक संकल्प प्रदान करता है और विभिन्न विलायक में संचालित किया जा सकता है के बाद से जैविक 1,2 और सिंथेटिक 3 सामग्री और सतहों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इमेजिंग तकनीक होने के लिए बाहर कर दिया गया वातावरण। इसके अलावा, AFM के एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS) शासन μN को पी.एन. से लेकर बलों को मापने के लिए सक्षम बनाता है और 4,5 तह प्रोटीन में उदाहरण के लिए अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि, बहुलक भौतिकी 6 दी है – 8, और एक अणु-सतह बातचीत 9 – एकल अणुओं के बजाय अणुओं का एक जोड़ा अध्ययन कर के पीछे 12 व्याप्ति तर्क अक्सर दुर्लभ घटनाओं या छिपा आणविक राज्यों मुखौटा जो प्रभाव के औसत से बचने के लिए है। इसके अलावा, इस तरह के आदि समोच्च लंबाई, कुहन लंबाई, आसंजन मुक्त ऊर्जा, के रूप में आणविक मापदंडों के एक भीड़ हो सकता हैप्राप्त की। यह नीचे दिए गए उदाहरणों में विस्तृत है। एक ठेठ है AFM-SMFS प्रयोग में, जांच अणु एक linker अणु के माध्यम से एक बहुत तेज टिप के लिए युग्मित है। टिप में ही एक bendable ब्रैकट के अंत में स्थित है। टिप सतह के साथ संपर्क में लाया जाता है तो जांच अणु इस सतह के साथ बातचीत करेंगे। सतह से अणु अलग करने के लिए, टिप, बल, और इसलिए मुक्त ऊर्जा का त्याग पर ब्रैकट के विक्षेपन के अवलोकन के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। सार्थक आँकड़े प्राप्त करने के लिए, तथाकथित बल दूरी घटता की एक बड़ी संख्या का अधिग्रहण किया जाना है। इसके अलावा, जांच अणु AFM टिप के लिए covalently मिलकर किया जाना चाहिए (यानी, एक और पूरे प्रयोग की अवधि से अधिक एक ही जांच अणु का उपयोग) सच्चे एकल अणु प्रयोगों के लिए है। इधर, एक सहसंयोजक बांड के माध्यम से एक ही अणु के साथ ब्रैकट functionalization के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। एक अणु या तो एक एमिनो या एक Thio के माध्यम से युग्मित किया जा सकता हैAFM टिप करने के लिए एल समूह। संयुग्मन प्रक्रिया का इस्तेमाल किया पॉलिमर के solvation गुणों के लिए खाते में (जैविक और जलीय) सॉल्वैंट्स का एक व्यापक विविधता में प्रदर्शन किया जा सकता है।
पहले भाग में, एक सामान्य प्रोटोकॉल covalently वर्णन किया गया है एक AFM टिप करने के लिए एक linker अणु के माध्यम से एक अणु ("जांच अणु") संलग्न करने के लिए। यह अंत करने, जैविक NHS- या maleimide-रसायन शास्त्र में 13 प्रयोग किया जाता है। तीन उदाहरण के अणुओं के लिए प्रोटोकॉल के साथ साथ, डाटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं में वर्णित हैं और आगे पढ़ने के लिए संदर्भ प्रदान की जाती हैं। उदाहरण के अणु होते हैं: (रैखिक) बहुलक टाइरोसीन, भ्रष्टाचार बहुलक PI- जी -PS और लिपिड पोप। उदाहरण covalently cysteines संलग्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल के मामूली बदलाव भी शामिल है। इसके अलावा, एक खंड में इस तरह के एक हीरे की सतह, एक सीएच 3 -self-इकट्ठे monolayer और लिपिड bilayers के रूप में विभिन्न सतहों की तैयारी के लिए समर्पित है। इन इंटरफेस Prov हैएन अच्छे संदर्भ और उदाहरण हो।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले दशकों के दौरान, एक अणु प्रयोगों आणविक तंत्र में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान की है और जीवन विज्ञान और परे में एक अमूल्य दृष्टिकोण होने के लिए बाहर कर दिया है। SMFS प्रयोगों, आदर्श एक और एक ही अणु प्र…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
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