Gransker enkelt molekyl Adhesjon av Atomic Force spektroskopi

Summary

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Abstract

Atomic force spektroskopi er et ideelt verktøy for å studere molekyler på overflater og grenseflater. En eksperimentell protokoll til par et stort utvalg av enkle molekyler kovalent på en AFM tips er presentert. Samtidig AFM spissen passiveres for å hindre uspesifikke interaksjoner mellom spissen og substratet, noe som er en forutsetning for å studere enkle molekyler festet til AFM spissen. Analyser å bestemme adhesjonskraften, vedheft lengde, og den frie energien av disse molekylene på faste overflater og bio-grensesnitt er kort tid presenteres og eksterne referanser til videre lesning er gitt. Eksempler på molekyler som er poly (aminosyre) polytyrosine, podepolymeren PI- g -ps og fosfolipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine). Disse molekylene desorberes fra forskjellige overflater som CH ₃ -SAMs, hydrogen avsluttet diamant og støttet lipidbilag under ulike løsemiddel forhold. Endeligfordelene ved force spektroskopiske enkelt molekyl eksperimenter blir diskutert inkludert midler til å avgjøre om virkelig et enkelt molekyl har blitt studert i forsøket.

Introduction

I løpet av de siste 30 årene har atomic force mikroskopi (AFM) viste seg å være en verdifull avbildningsteknikk for å studere biologiske ^1,2 og syntetiske ^tre materialer og overflater siden det gir molekylær romlig oppløsning i alle tre dimensjoner, og kan brukes i ulike løsemiddel miljøer. I tillegg AFM-enkelt molekyl kraft spektroskopi (SMFS) gjør det mulig å måle krefter som spenner fra PN til μN regime og har gitt enestående innsikt for eksempel i protein folding ^4,5, polymer fysikk ^{6 – 8,} og enkelt molekyl-overflate interaksjon ^{9 – 12} sikret rasjonale bak å studere enkeltmolekyler i stedet for et ensemble av molekyler er å unngå snitt effekter som ofte maskere sjeldne hendelser eller skjulte molekylære stater. Videre kan et mangfold av molekylære parametre som konturen lengde, Kuhn lengde, adhesjonen fri energi, etc. bliinnhentet. Dette er detaljert beskrevet i eksemplene nedenfor. I en typisk AFM-SMFS eksperimentet blir sondemolekyl koblet til en meget skarp spiss via et linkermolekyl. Spissen selv ligger ved enden av en bøyelig cantilever. Dersom spissen bringes i kontakt med overflaten til sonden molekylet skal samvirke med denne overflaten. Ved å betrakte avbøyningen av braket ved tilbaketrekkingen av spissen, den kraft, og således den frie energi, for å løsne molekylet fra overflaten kan bestemmes. For å få meningsfulle statistikk, et stort antall såkalte tvangs avstand kurver har å bli kjøpt opp. Videre, for å ha sanne enkelt molekyl forsøk (dvs. ved hjelp av en og samme sonde molekyl over varigheten av hele forsøket) sondemolekylet bør koples kovalent til AFM spissen. Her blir en eksperimentell protokoll for cantilever funksjonalisering med en enkelt molekyl via en kovalent binding presentert. Den eneste molekyl kan enten være koplet via en amino- eller en tiol gruppe til AFM spissen. Konjugeringen prosessen kan utføres i et bredt spekter av oppløsningsmidler (organisk og vandig) for å gjøre rede for solvatisering egenskaper av de polymerer som anvendes.

I den første del, en generell protokoll for kovalent å feste et enkelt molekyl ("probe-molekyl") via en linkermolekyl til en AFM spissen er beskrevet. Til dette formål er organiske NHS- eller maleimid-kjemien anvendt ^13. Sammen med protokollen for tre eksempel molekyler, blir datainnsamling og dataanalyse prosesser beskrevet og referanser til videre lesning er gitt. Eksemplene molekyler er: (lineær) polymer tyrosin, podepolymeren PI- g -ps og lipid POPE. Dette inkluderer små variasjoner i protokollen, for eksempel for å kovalent feste cysteiner. I tillegg er en del dedikert til fremstilling av forskjellige overflater slik som en diamantoverflate, en _CH3 -Self montert monolag og lipidbilag. Disse grensesnittene har provno for å være gode referanser og eksempler.

Protocol

MERK: Se figur 2 for en oversikt over prosessen flyt omfatter forberedelse, de datainnsamling og dataanalyse trinn. 1. Reagens Setup MERK: Alle kjemikalier må håndteres med forsiktighet, og dermed en laboratoriefrakk, hansker og vernebriller bør brukes. Alle operasjoner må utføres i et laboratorium hette. Særlig bør spesialhansker i tilfelle av kloroform bruk. Bruke kjemikalier med lavt vanninnhold, som tørr kloroform raskt og …

Representative Results

I det følgende er resultatene for de ovenfor beskrevne eksempel molekyler, nemlig polymerer som poly (aminosyre) polytyrosine, podepolymeren PI- g -ps og fosfolipid POPE, er presentert. Først for hvert eksempel eksperimentere spesifikke opplysninger om datainnsamling og data forberedelse er gitt. Deretter blir de eksempelvise resultatene for forsøk hvor disse molekyler ble desorbert fra forskjellige overflater (CH3 -SAMs, hydrogenterminerte diamant og lipidbilag) vist. Bestemmelse av adhesjonskraf…

Discussion

I løpet av de siste tiårene, har enkelt molekyl eksperimenter gitt enestående innsikt i molekylære mekanismer og viste seg å være en uvurderlig tilnærming i life science og utover. For å oppnå gode og meningsfulle statistikker fra SMFS eksperimenter, ideelt sett en og samme molekyl blir brukt over hele forløpet av eksperimentet. I motsetning til forsøk med ensembler av molekyler, SMFS eksperimenter er i stand til å oppdage sjeldne hendelser og skjulte molekylære stater. En annen fordel med enkelt molekyl ek…

Materials

Materials
Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)	Hellma
RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))	Sigma
Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane	Vectorlabs
Dry acetone (< 50 ppm H2O)	Sigma
Dry chloroform (> 99.9 %)	Sigma
Triethylamine	Sigma
Ultrapure water	Biochrom, Germany
Di-sodium tetraborate (> 99.5 %)	Biochrom, Germany
Boric Acid	Biochrom, Germany
Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
Equipment
Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids	VWR International GmbH, Germany
Laboratory oven model UF30	Memmert, Germany
Temperature controlled sonicator	VWR International GmbH, Germany
Plasma system "Femto", 100 W	Diener, Germany
One separate glass syringe for each organic solvent	VWR International GmbH, Germany
Vortex mixer	VWR International GmbH, Germany
Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)	Eppendorf
Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl	Eppendorf
AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)	Bruker AXS, Santa Barbara