Undersöka enda molekyl Adhesion av Atomic Force spektroskopi
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Atomkrafts spektroskopi är ett idealiskt verktyg för att studera molekyler på ytor och gränssnitt. Ett försöksprotokoll för att koppla en stor variation av enstaka molekyler kovalent på en AFM spets presenteras. Samtidigt AFM spets är passiverad för att förhindra ospecifika interaktioner mellan spetsen och substratet, vilket är en förutsättning för att studera enstaka molekyler bundna till AFM spets. Analyser för att bestämma vidhäftningskraften, vidhäftningslängden, och den fria energin av dessa molekyler på fasta ytor och bio-gränssnitt inom kort presenteras och externa referenser för vidare läsning tillhandahålls. Exempel molekyler är poly (aminosyra) polytyrosine, ymppolymeren PI- g -PS och fosfolipiden POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfoetanolamin). Dessa molekyler desorberas från olika ytor som CH 3 -SAMs, vätgas avslutas diamant och stödde lipidbiskikt under olika lösningsmedels förhållanden. SlutligenFördelarna med kraft spektroskopiska enstaka molekyl experiment diskuteras fattande organ för att avgöra om verkligen en enda molekyl har studerats i experimentet.
Introduction
Under de senaste 30 åren, har atomkraftsmikroskopi (AFM) visade sig vara en värdefull bildteknik för att studera biologiska 1,2 och syntetiska 3 material och ytor, eftersom det ger molekylär rumslig upplösning i alla tre dimensioner och kan användas i olika lösningsmedel miljöer. Dessutom AFM-enda molekyl force spektroskopi (SMF) gör det möjligt att mäta krafter som sträcker sig från PN att μN regimen och har gett helt nya kunskaper till exempel till protein vika 4,5, polymerfysik 6 – 8, och enda molekyl-ytan interaktion 9 – 12 .Den logiken bakom att studera enstaka molekyler snarare än en ensemble av molekyler är att undvika genomsnitt effekter som ofta döljer sällsynta händelser eller dolda molekylära stater. Dessutom kan en mängd molekylära parametrar såsom konturlängden, den Kuhn längden, vidhäftningen fri energi, etc. varaerhålles. Detta beskrivs närmare i exemplen nedan. I en typisk AFM-SMF experimentet är sonden molekyl kopplad till en mycket vass spets via en länkmolekyl. Spetsen själv ligger vid slutet av en böjbar fribärande. Om spetsen bringas i kontakt med ytan av sondmolekylen kommer att interagera med denna yta. Genom att observera avböjningen av den fribärande vid tillbakadragning av spetsen, den kraft, och därmed den fria energin, att lösgöra molekylen från ytan kan bestämmas. För att erhålla meningsfull statistik, har förvärvas ett stort antal så kallade tvångsavståndskurvor. Dessutom att ha riktiga enda molekyl experiment (dvs, som använder en och samma sond molekyl under hela hela experimentet) sondmolekylen bör kopplas kovalent till AFM spets. Här är ett experimentellt protokoll för fribärande funktion med en enda molekyl via en kovalent bindning presenteras. Den enda molekyl kan antingen kopplas via en amino- eller en tio-l grupp till AFM spets. Konjugeringen Processen kan utföras i en bred variation av lösningsmedel (organiska och vattenhaltiga) redogöra för solvatisering egenskaperna hos de polymerer som används.
I den första delen, ett allmänt protokoll för att kovalent fästa en enda molekyl ("sond-molekyl") via en länkmolekyl till en AFM spets beskrivs. För detta ändamål är organisk NHS- eller maleimid-kemi används 13. Tillsammans med protokollet för tre exempel molekyler, är datainsamling och dataanalys processer beskrivs och referenser för vidare läsning finns. Exempel molekylerna är: (linjär) polymer tyrosin, ymppolymeren PI- g -PS och lipid påven. Detta innefattar små variationer i protokollet, till exempel för att kovalent fästa cysteiner. Dessutom är ett avsnitt om beredning av olika ytor såsom en diamant yta, en CH 3 själven-monterade monolager och lipidbiskikt. Dessa gränssnitt har provsv att vara goda referenser och exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste decennierna har enstaka molekyl experiment tillhandahålls oanade insikter i molekylära mekanismer och visade sig vara en ovärderlig förhållningssätt inom life science och utanför. För att uppnå goda och meningsfull statistik från SMF experiment, helst en och samma molekyl används över hela experimentets. I motsats till experiment med ensembler av molekyler, SMF experiment kan upptäcka sällsynta händelser och dolda molekylära stater. En annan fördel med enda molekyl experiment är att de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a., et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
- Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction – The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
