This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.
In diesem Bericht beschreiben wir die Anwendung der im nahen Infrarot-Fluorophor-markierten Sonden für die Validierung der in vivo-Xenotransplantat-Abbildungsexperimente unter Verwendung von ex vivo Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie der sezierten Xenograft. Vergleicht man eine einzelne Domäne Nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 und einem monoklonalen Antikörper (Nika102, 150 kDa) 2,3 auf den gleichen Zielantigen für bestimmte in vivo gerichtet Nahinfrarot-Fluoreszenzabbildung in einem Lymphom-Xenotransplantat-Modell. Das Zielantigen ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 als GPI-verankerten Zelloberfläche Ekto-Enzyms durch Lymphomzellen 4-9 exprimiert.
Nanobodies von Kameliden abgeleiteten Schwerketten-Antikörper nur sind die kleinsten verfügbaren antigenbindende Fragmente 10,11. Mit nur ca. 15 kDa, diese kleine Antikörperfragmente löslich, sehr stabil und über die Nieren aus dem Verkehr 8,10 gelöscht. Tiese Eigenschaften machen sie besonders geeignet für die spezifische und effiziente Ausrichtung der Tumorantigene in vivo 12-20. Common Antigen Ziele verfügbaren Nanobodies sind die epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR1 oder HER-1), den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Typ 2 (HER-2 oder CD340), carcinoembryonales Antigen (CEA) und das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody Konjugate sind vielversprechende Werkzeuge für die Immuntherapie von Krebs und Behandlung von entzündlichen Erkrankungen 22.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass Nanobodies ermöglichen höhere Tumor-zu-Hintergrund (T / B) -ratios als herkömmliche Antikörper in in vivo-Anwendungen der molekularen Bildgebung 8,17,19. Dies wird vor allem durch den relativ schlechten und langsamen Gewebepenetration von konventionellen Antikörpern, langsame Clearance aus dem Kreislauf und lange Verweildauer in Nicht-Zielgewebe 23 erläutert. Außerdem Schuß konventionellen Antikörpern führt zu unspezifische Akkumulation in Ziel-Antigen-negativen Tumoren durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) hervorgerufen worden ist 24,25. Dies bedeutet, dass höhere Dosen konventioneller Antikörper können nicht nur spezifische Signale, sondern auch nicht-spezifische Signale zu erhöhen, wodurch die maximal erreichbare Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnis. Im Gegensatz dazu eine Erhöhung der Dosis von Nano erhöht die Signale von Antigen-positiven Tumoren, aber nicht von normalen Gewebe oder Antigen-negative Tumoren (unveröffentlichte Daten).
Über den Vergleich von Nanobodies und konventionellen Antikörpern beschreiben wir eine intraindividuelle Beurteilung der Antigen-positiven und -negativen Xenotransplantaten in derselben Mäuse zum direkten Vergleich der spezifischen und unspezifischen Signale aufgrund der EPR-Effekt. Die Nah-Infrarot-Fluorophor konjugierten Sonden uns erlaubt, eine einzelne Sonde in vivo und ex vivo mit Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging auszunutzen, Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Die Anwendung unserer Protokolle ermöglicht nichtradioaktive, hochempfindliche und kostengünstige Optimierung der in vivo molekulare Bildgebung Experimente wie Evaluierung neuer Antikörperkonstrukte für bestimmte Tumor-Targeting.
Das Ziel dieses Tutorials Studie ist, die Verwendung von NIRF-Bildgebung zur Beurteilung der neuen Antikörperkonstrukte in präklinischen molekularen Bildgebung zu markieren.
In diesem Protokoll wurden alle Versuche mit einem Kleintier-NIRF-Abbildungssystem durchgeführt wird, ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS) Durchflusszytometer und einem konfokalen Mikroskop.
Wir verwendeten im nahen Infrarot-Fluorophor markierten Nanokörper und konventioneller monoklonaler Antikörper gegen das gleiche Ziel auf Lymphomzellen gerichtet für eine multimodale Vergleich von in vivo und ex vivo-Analysen. Wir haben gezeigt, dass Nanokörper sind auch Diagnose-Tools für eine schnelle und spezifische in vivo Detektion von Lymphomen geeignet.
In vivo, s + 16a 680 erlaubt einen schnellen und spezifischen Nachweis von ARTC2-positive Fremdtransplantaten. Abgesehen von der unterschiedlichen Kinetik besten Tumor Visualisierung in vivo, ein schwerwiegender Nachteil Nika102 680 war die hohe unspezifische Signal von ARTC2-negative Tumoren und unspezifische Hintergrundsignale.
Ex vivo durchflusszytometrischen Analysen von dispergierten Zellen aus sezierten Tumoren zeigten keine spezifische Bindung zu ARTC2-negativen Lymphomzellen injiziert AF680-Konjugate. Ex vivo Fluoreszenz zeigte starke und nahezu homogenschiedenen Färbung von Zellen in ART2C-positive Tumorschnitte im Falle von Nanobody s + 16a, bestätigt, dass die Nanokörper konnte auch abgelegene Gebiete innerhalb des Tumors nach 6 h. Im Gegensatz dazu zeigte der monoklonale Antikörper schwächer und inhomogene Färbung von Zellen in ARTC2-positiven Tumoren nach 6 Std. Bessere Abbildungsergebnisse mit dem herkömmlichen Antikörpers kann nach 24 h oder 48 h erreicht werden (Daten nicht gezeigt). Um eine gründliche Vergleich zweier unterschiedlich großer Konstrukte auszuführen, abbild zu verschiedenen Zeitpunkten (serial-Bildgebung) durchgeführt, um die optimale Bilderzeugungszeitpunkt für jedes Konstrukt zu identifizieren.
Wie bei anderen früheren Studien, die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, dass in vivo molekulare Bildgebung mit markierten Nanokörper ermöglicht eine schnelle und spezifische selben Tag Tumordarstellung mit hoher Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse 12-15,17-19. Umgekehrt führen herkömmliche Antikörper in niedrigen Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse und unspezifische Signale von Antigen-negativen Tumoren früh nach der Injektion aufgrund ihrer langsamen Clearance aus dem Körper. Um eine optimale Bildergebnisse mit konventionellen Antikörpern zu erhalten, bildgebenden Zeitpunkten 24 Stunden oder sogar 48 Stunden nach der Injektion werden häufig benötigt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die vorgeschlagen haben, dass konventionelle Antikörper mit bewährten therapeutischen Nutzen haben Dienstprogramm in der molekularen Bildgebung 17,19,26 begrenzt. Daher konventionellen Antikörpern könnte zu therapeutischen Zwecken nicht geeignet sein, die aufgrund ihrer langen Plasmahalbwertszeit während der Nanokörper sind zur Bildgebung und nicht geeignet, die aufgrund ihrer schnellen Clearance aus dem Kreislauf. Diese Unterschiede sind auf die Tatsache zurückzuführen, dass ein Überschuss der kleineren Nanobodies (15-17 kDa) rasch über die renale Elimination gelöscht, während über größeren konventionellen Antikörpern (150 kDa) in den Kreislauf zurückgehalten. So der große Vorteil von Nanokörpern für die molekulare Bildgebung ist die geringe Hintergrundsignal in frühen Bildzeitpunkten regardless der injizierten Dosis. Auf diese Weise können am gleichen Tag Bildgebung und konnte übersetzbar klinischen Umfeld. Umgekehrt können, müssen herkömmliche Antikörper genau titriert, um die unspezifische Hintergrundsignale zu minimieren, und gleichzeitig genügend spezifische Signal von der Zielgewebe (unveröffentlichte Daten) werden.
Eine der Einschränkungen der in vivo NIRF-Bildgebungstechnik ist die geringe Eindringtiefe der Regel erlaubt nur Abbildungs subkutaner aber nicht orthotope Tumormodellen. Allerdings könnte diese Einschränkung in einer experimentellen Einstellung durch die neu entwickelten tomographischen photoakustischen Techniken, die Ganzkörper-Bildgebung von lebenden Mäusen 27 ermöglichen überwunden werden. Eine weitere Einschränkung des NIRF-Bildgebungstechnik ist die Beurteilung des Gewebe Dosis verglichen mit Radionuklid-vermittelte Bildgebung. Jedoch können die Nanokörper für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung des Xenograft-Modellen und genaue quantitative Beurteilung der radioaktiv markiert werdenTracer Bioverteilung. Tatsächlich sind unsere NIRF-Abbildungsergebnisse in Übereinstimmung mit einer neueren Untersuchung, die Nanokörper und herkömmliche Antikörper für die PET-Bildgebung verglichen. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Nanobodies ermöglichen selben Tag Bildgebung mit hoher Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse 15.
Nur die Markierung von Antikörperkonstrukten mit der Nah-Infrarot fluoreszierenden Farbstoff AF680 erlaubt jedoch uns umfangreiche in vitro, in vivo und ex vivo Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung Vergleich mittels Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie und NIRF-Bildgebung. Aus diesem Grund und weil es nicht radioaktives, hochempfindliche, kostengünstig und verwendet vergleichsweise einfach zu produzieren gezielte Sonden treten wir die Verwendung des NIRF-Abbildungsverfahren für die Bewertung der neuen Antikörperkonstrukte in präklinischen molekularen Bildgebung.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Graduiertenschule "Inflammation und Regeneration" des Sonderforschungsbereich 841 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), durch den Sonderforschungsbereich 877 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) unterstützt , von der Werner Otto Stiftung (Peter Bannas), von der Wilhelm Sander-Stiftung (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte) und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag und Friedrich Koch-Nolte). Wir danken dem Universitäts Krebscentrum Hamburg (UCCH) In-vivo-Optical Imaging Core Facility und das Personal an UKE für die Konsultation und ihre qualitativ hochwertigen Service. Die Core Facility wurde zum Teil durch Zuschüsse von der Deutschen Krebshilfe (Deutsche Krebshilfe) unterstützt.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | n/a | Other cells with different surface targets can be used |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |