استخدام إنتاجية عالية<em> في المختبر</em> نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم
Summary
والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف استخدام نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على الأنواع التي تم تحديدها عادة في الإنسان لوحة الأسنان فوق اللثة. طرق لوصف العمارة بيوفيلم، قابلية بيوفيلم، ونهجا لحصاد بيوفيلم عن التحليلات التي تعتمد على الثقافة أو ثقافة مستقلة وتسليط الضوء عليها.
Abstract
وهناك عدد قليل الإنتاجية العالية في أنظمة المختبر التي تسهل تطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على العديد من الأنواع الكشف عن عادة داخل الجسم الحي في الأغشية الحيوية عن طريق الفم. وعلاوة على ذلك، وهو النظام الذي يستخدم اللعاب البشري الطبيعي كمصدر المغذيات، بدلا من وسائل الإعلام الاصطناعي، أمر مرغوب فيه ولا سيما من أجل دعم التعبير عن الخصائص الخلوية وبيوفيلم محددة التي تحاكي المجتمعات في الجسم الحي. نحن تصف طريقة لتطوير أنواع متعددة الأغشية الحيوية عن طريق الفم التي هي قابلة للمقارنة، فيما يتعلق تكوين الأنواع، إلى فوق اللثة لوحة الأسنان، في ظل ظروف مماثلة لتجويف الفم البشري. على وجه التحديد، وهذه المادة طرق يصف كيف يمكن تكييف نظام ميكروفلويديك المتاحة تجاريا لتسهيل تطوير أنواع متعددة الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستمدة من ونمت داخل اللعاب المجمعة. وعلاوة على ذلك، وصفا لكيفية النظام يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع confocaل يزر المسح المجهر لتوليد 3-D إعادة البناء بيوفيلم للتحليلات المعمارية وقدرتها على البقاء وستعرض. ونظرا لتنوع واسع من الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو داخل الأغشية الحيوية في النظام ميكروفلويديك (بما في ذلك العقدية، النيسرية، الفيونيلة، Gemella، وPorphyromonas)، كما سيتم عرض بروتوكول تصف كيفية حصاد الخلايا بيوفيلم لمزيد من ثقافة فرعية أو استخراج الحمض النووي والتحليل. سيتم تناولها حدود كل من نظام بيوفيلم ميكروفلويديك والتحليلات الحالية بيانات للدولة من بين الفن. في نهاية المطاف، ومن المتوقع أن هذه المادة سوف توفر تقنية خط الأساس التي من شأنها تحسين دراسة الأغشية الحيوية عن طريق الفم ومساعدة في تطوير تكنولوجيات الإضافية التي يمكن أن تكون متكاملة مع منصة ميكروفلويديك.
Introduction
الأغشية الحيوية هي معماريا المجتمعات المعقدة من البكتيريا التي يتم تجميعها على الأسطح 1. يتضمن هذه المجتمعات عادة عديد من الأنواع التي تتفاعل فيما بينها ضمن بيوفيلم 2. الأغشية الحيوية عن طريق الفم، والأكثر واضحة بصريا كونها لوحة الأسنان، هي مشكلة مستمرة في البشر ونتائجها التنمية العشوائية في توليد المجتمعات متعددة الأنواع المتنوعة تصنيفيا 3. البكتيريا المكونة لهذه المجتمعات المتنوعة يمكن أن تصل إلى 1،000 مرات أكثر مقاومة للميكروبات مما هم التعويم الحر (البلانكتون) نظرائهم 4-6. الفشل في علاج هذه المجتمعات بيوفيلم عن طريق الفم، والذي يمكن أن يسبب تسوس الأسنان وأمراض اللثة، وقد نتج عن ذلك عبء جسيم للصحة العامة: أكثر من 500 مليون مرة إلى مكتب طبيب الأسنان سنويا في الولايات المتحدة، وبنحو 108 مليار دولار لعلاج أو منع اللثة المرض وتسوس الأسنان 7.
المحتوى ">" في حين تدافع العديد من علماء الأحياء المجهرية دراسة السلوك الميكروبي تحت الظروف الطبيعية، وقليل منهم القيام بذلك. وذلك لأن معنوياتهم للتغلب على الصعوبات التي استنزفت باستمرار من قبل سهولة جذابة للعمل مع الثقافات المختبر. "-Smith 8.في الوقت الحاضر، وأجرى أبحاثا بيوفيلم عن طريق الفم باستخدام مجموعة متنوعة من المجراة في النهج المختبر، ولكل منها مزاياها وعيوبها 9،10. في المختبر النهج غالبا ما تستخدم أنظمة بيوفيلم نموذج التي هي سهلة نسبيا لاقامة ولكنها قد تفتقر السريرية / أهمية في العالم الحقيقي 10،11. في الجسم الحي تعتمد النهج عادة على نظم نموذج حيواني التي قد تتكاثر بعض جوانب البيئة عن طريق الفم الإنسان، ولكن مرة أخرى تعاني من القيود بسبب الاختلافات في علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة بين الحيوانات والبشر 12، 13. وتجدر الإشارة إلى أن الأغشية الحيوية عن طريق الفميمكن أيضا أن تكون وضعت على الأسطح المينا الذي عقد في دعامة داخل أفواه متطوعين من البشر، ولكن هذا النهج هو حاليا مكلفة نسبيا و14،15 كثيفة العمالة. في نهاية المطاف، ويتم اختبار وكلاء أو التقنيات لتحسين الرعاية الصحية عن طريق الفم رواية في البشر في ظل ظروف التجارب السريرية التي تسيطر عليها (11). في الوقت الحاضر، وهي طريقة عمل غالبا ما تستخدم لتحديد وتقييم وكلاء الرعاية الصحية عن طريق الفم الجديد هو لأداء أول الدراسات المختبرية لتبين فعالية المحتملة، ثم قم بإجراء دراسات على الحيوانات و "التجارب الميدانية" التي توظف أطباء لتقييم مدى نجاح هذه التكنولوجيا 9، 16،17. للأسف، الدراسات المختبرية تميل إلى الاعتماد على أنظمة نموذج التي تشغل بصمة كبيرة، تمثل تحديا تقنيا للاستخدام، وغالبا ما تحتوي على المجتمعات مبسطة من واحد أو أكثر في عدد قليل من الأنواع لاستخلاص المحتملين في العالم الحقيقي يعني 10،18. وبالنظر إلى أن الأغشية الحيوية لوحة الأسنان تحتوي على أنواع متعددة، والنموذج في مجمعات للالسابق تتدفق الوسط اللعاب، وتطوير الأغشية الحيوية التي تحتوي على واحد أو عدد قليل من الأنواع في وسائل الإعلام الاصطناعي من غير المرجح أن تولد المجتمعات التي تتصرف بطريقة مشابهة لتلك التي في سيناريو العالم الحقيقي 10،19. لمعالجة الوقت والتكلفة، ومتطلبات التدريب، وطبيعة تمثيلية رديئة من أنظمة بيوفيلم نموذج المختبر بالمقارنة مع البيئة في العالم الحقيقي، وضعنا مؤخرا إنتاجية عالية ونظام بيوفيلم ثيق للبيئة 20 (الشكل 1). فوائد النظام من استخدام اللعاب خالية من الخلايا المجمعة البشري (CFS) كما تجمع البكتيريا اللعاب التي تحتوي على الخلايا البشرية المتوسطة وغير المعالجة (CCS) بمثابة اللقاح. فريد، والنظام أيضا يجمع بين تكنولوجيا ميكروفلويديك، وهو متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر، والتنوع البكتيري تكنولوجيا التحليل ثقافة مستقلة. وهكذا، فإن نظام النموذج هو ثيق للبيئة (باستخدام اللعاب بمثابة اللقاح لتنمو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في 37 ° C في فلتر تعقيم تتدفقاللعاب) والأغشية الحيوية عن طريق الفم تحتوي على الأنواع (بما في ذلك العقدية، النيسرية، الفيونيلة، والأنواع Porphyromonas) في ممثل وفرة من تلك التي وجدت في وقت مبكر وحة فوق لثوي 20.
عندما اعتبر أن هذا العمل يصف استخدام نظام نموذجي وضعت حديثا، ويجب إيلاء اهتمام خاص لدمج ومتحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر (CLSM) على microfluidics، وتقنيات تحليل التنوع ثقافة مستقلة. وكان اتحاد هذه التقنيات من قبل مجموعة بحثنا عن قصد وليس فقط يضيف القدرة الإنتاجية العالية لنظام نموذجي وضعت حديثا، ولكن يسمح أيضا طرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها بسهولة من قبل مع النظم الأخرى. أولا، CLSM ديه مزايا واضحة على المجهري التقليدي لأنها تسمح لتحليل ثلاثي الأبعاد من الأغشية الحيوية. في كثير من الأحيان محل تقدير، وهذا مهم للغاية كما الأغشية الحيوية هي خفة دم غير متجانسةح يتعلق تكوين الأنواع وموقف المكاني فضلا عن الظروف الفسيولوجية التي يجري فرضها في مواقع مكانية مختلفة داخل بيوفيلم 6،21. بالتنسيق مع برنامج ثلاثي الأبعاد تقديم وصورة برامج التحليل، والهندسة المعمارية بيوفيلم، والعلاقات المكانية بين الأنواع المكونة، ومدى قتل المضادة للجراثيم يمكن تحليلها 22-24. هذه القدرات ليست ممكنة باستخدام معيار الضوء المرسل أو المجهري epifluorescence. وبعد ذلك، قد حصل على microfluidics اهتماما خاصا في مجال علم الأحياء المجهرية، لأنها تتيح دراسة الأغشية الحيوية تحت ظروف محكومة بعناية (التدفق، ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، الخ) ويتطلب سوى كميات صغيرة من السائل 25-27. كنقطة المقارنة، وتزايد على بيوفيلم عن طريق الفم في اللعاب البشري ضمن نظام نموذج خلية تدفق (النظام الذي يعتبر يمكن القول إن النموذج الدعامة الأساسية للعديد من الدراسات بيوفيلم عن طريق الفم) لمدة 20 ساعة بمعدل تدفق مماثل والقص كما ان يتحققفي نظام ميكروفلويديك يتطلب لا يقل عن 200 مل، في مقابل 800 ميكرولتر في الجهاز ميكروفلويديك 28-31. وهكذا، فإن النظام النموذجي بيوفيلم ميكروفلويديك تمكن الدراسة من المواد محدودة الكمية في ظل ظروف محددة. وأخيرا، فقد تم تحسين التكنولوجيا سلسلة البايرو في العقد الماضي للا تتطلب سوى كميات صغيرة من المواد لإجراء تحليل المجتمع وهي متعددة بما فيه الكفاية للسيطرة على عمق التسلسل للحصول على هوية الأنواع بيوفيلم حتى النادرة. استخدام هذه التكنولوجيا، مثل البكتيريا ترميز العلامة FLX amplicon سلسلة البايرو (bTEFAP)، وقد سمح لطرح الأسئلة ذات الصلة بشأن البيئة من الأغشية الحيوية التي ينبغي معالجتها 32،33. مثل هذه الأسئلة التى تصطبغ صعوبات في الماضي عندما كانت سلسلة البايرو غير متوفر بسبب الوقت والتكاليف اللازمة لإنشاء مكتبات البلازميد والخطوات التكنولوجية والتحليلية المعقدة اللازمة لاستخلاص البيانات 33،34. وبطبيعة الحال، وهي ميزة كبيرة مع ثقافة مستقلة ا ف بمقاربات، مثل سلسلة البايرو، هو أن الأنواع البكتيرية التي لا يمكن زراعتها في عزلة داخل وسائل الإعلام مختبر التقليدي (الأنواع أي قابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة) يمكن زراعتها والتعرف داخل منظومة نموذج والوفرة النسبية في المجتمع كميا 35، 36 . لإضافة المنظور، في وقت مبكر من عام 1963، قدرت في وقت متأخر سيغموند Socransky أن ما يقرب من 50٪ من البكتيريا في المواد معزولة عن طريق الفم اللثة شق البشري لا يمكن زرع باستخدام ظروف النمو مختبر 37.
والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف النهج لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم في ميكروفلويديك (Bioflux) النظام المتوفرة تجاريا تحت: (ط) الظروف ممثل تجويف الفم البشري و (ii) مع تكوين الأنواع ووفرتها أن غير قابلة للمقارنة لوحة فوق اللثة. وعلاوة على ذلك، باستخدام كل البرامج مجانية والتجاري، نسلط الضوء بيوفيلم كيف الأساسييمكن أن تستمد التدابير الهندسة المعمارية من البيانات CLSM، مع التركيز على النهج لقياس الكتلة الحيوية بيوفيلم، خشونة، وقدرتها على البقاء (على أساس لايف / تلطيخ الميت). وأخيرا، تم وصفها الخطوات المطلوبة لحصاد المواد بيوفيلم لتحليل التنوع كتبها bTEFAP.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتبرز هذه الورقة طرق الخطوات الأساسية اللازمة لإعداد وتشغيل نظام ميكروفلويديك بطريقة للسماح لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم المستمدة من لعاب الإنسان المجمعة والتي تزرع في فلتر تعقيم 25٪ المجمعة لعاب الإنسان. يتم إعطاء النهج لتوصيف بيوفيلم ولكن ي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر وليام نانس (جامعة ميشيغان) للمساعدة في صياغة بروتوكولات نمو بيوفيلم وجون باتيستا (الجريان، وسان فرانسيسكو، CA) للحصول على المشورة بشأن المسائل التكنولوجية المتعلقة بنظام Bioflux. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH: R21DE018820 إلى AHR) وجامعة ميشيغان الأموال بدء لAHR
Materials
| SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
| Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| SOFTWARE | ||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | |
| Imaris | Bitplane | |
| Leica SPE | Leica | |
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | |
References
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
- Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
- Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
- Anon, . Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).
- Smith, H., Smith, H., Taylor, J. . Microbial behavior, ‘in vivo’ and ‘in vitro. , 1-29 (1964).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
- McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
- Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
- Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
- Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
- Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
- Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
- Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
- Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
- Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
- Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
- Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
- Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
- Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists’ Association. 85 (4), 256-263 (2011).
- Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
- Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
- Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
- Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
- Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
- Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
- Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).
