שימוש בתפוקה גבוהה<em> במבחנה</em> מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה
Summary
מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.
Abstract
יש תפוקה גבוהה כמה במערכות חוץ גופית שתקלנה על הפיתוח של biofilms רב-מינים המכילים מינים רבים מזוהים בדרך כלל בתוך in vivo biofilms האוראלי. יתר על כן, מערכת המשתמשת ברוק אנושי טבעי כמקור התזונתי, במקום תקשורת המלאכותית, במיוחד רצויה על מנת לתמוך בביטוי של מאפיינים סלולריים וbiofilm ספציפי המחקים את in vivo הקהילות. אנו מתארים שיטה לפיתוח רב-מינים biofilms האוראלי כי הם דומים, ביחס להרכב מינים, לsupragingival רובד שיניים, בתנאים דומים לחלל הפה האנושי. באופן ספציפי, מאמר שיטות זה יתאר כיצד מערכת microfluidic זמינה מסחרי יכולה להיות מותאם כדי להקל על הפיתוח של biofilms האוראלי רב-מינים שמקורם וגדלה בתוך רוק נקווה. יתר על כן, תיאור של איך המערכת יכול לשמש בשילוב עם confocaמיקרוסקופ סריקת לייזר l לייצר שחזורי biofilm 3-D עבור ניתוחי כדאיות אדריכליים ויוצג. בהתחשב במגוון הרחב של מיקרו-אורגניזמים הגדלים בתוך biofilms במערכת microfluidic (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, וPorphyromonas), פרוטוקול יהיה גם הציג מתאר כיצד לקצור את תאי biofilm לתת-תרבות נוספת או מיצוי DNA וניתוח. גבולות הן את מערכת biofilm microfluidic ומנתח את הנתונים הנוכחיים מדינה-of-the-האמנות יטופלו. סופו של דבר, הוא חזה שמאמר זה יספק טכניקה בסיסית שתשפר את המחקר של biofilms האוראלי ולסייע בפיתוח של טכנולוגיות נוספות שיכול להיות משולבת עם פלטפורמת microfluidic.
Introduction
Biofilms הם ארכיטקטוני קהילות מורכבות של חיידקים המצטברות על משטחי 1. קהילות אלה מכילים בדרך כלל מינים רבים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני בתוך biofilm 2. biofilms האוראלי, רובד השיניים להיות ביותר מבחינה ויזואלית הבולט, הוא בעיה מתמשכת בבני אדם ותוצאות הפיתוח בלתי מבוקרות שלהם בדור של קהילות רב-מינים טקסונומית מגוונות 3. חיידקי המרכיב של קהילות המגוונות אלה יכולים להיות עד 1,000 פעמים יותר עמידות לאנטיביוטיקה מאשר עמיתיהם משתנה חופשיים (פלנקטון) 4-6. כישלון לטיפול ביישובים אלה אוראליים biofilm, אשר יכול לגרום לעששת ומחלת חניכיים, הביא נטל משמעותי על בריאות ציבור: למעלה מ -500 מיליון ביקורים במשרד רופא השיניים בשנה בארה"ב, וכ -108 מליארד דולרים לטיפול באו למנוע חניכיים מחלה ועששת 7.
תוכן ">" בעוד מיקרוביולוגים רבים תומכים בלימוד התנהגות של חיידקים בתנאים טבעיים, כמה מהם לעשות זאת. סיבה לכך הוא המורל שלהם להתגבר על הקשיים מתפוגג ללא הרף על ידי הקלות אטרקטיביות של עבודה עם תרבויות מעבדה. "-Smith 8.נכון לעכשיו, מחקר biofilm אוראלי מתבצע תוך שימוש במגוון של in vivo ובגישות חוץ גופית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משל 9,10. במבחנה גישות לעתים קרובות משתמש במערכות biofilm מודל שהנן קלים יחסית להגדיר אבל ייתכן חוסר קליני / רלוונטי בעולם האמיתי 10,11. בvivo גישות בדרך כלל להסתמך על מערכות מודל חיה שעלול להתרבות היבטים מסוימים של סביבת הפה האנושית, אבל שוב סובלים ממגבלות בשל הבדלים באנטומיה, פיזיולוגיה, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה בין חיות ובני האדם 12, 13. יש לציין כי biofilms האוראלייכול להיות גם שפותח על משטחי אמייל שנערכו בסטנט בתוך הפה של מתנדבים אנושיים, אבל גישה זו היא כיום יחסית יקרה ועתירת עבודה 14,15. סופו של דבר, סוכנים או טכנולוגיות לשיפור בריאות פה רומן נבדקים בבני אדם בתנאי ניסוי קליניים מבוקרים 11. נכון לעכשיו, דרך פעולה לעתים קרובות נעשה שימוש לזיהוי והערכת סוכני בריאות פה חדשים היא לבצע מחקרי המעבדה ראשון להבחין ביעילות פוטנציאלית, ולאחר מכן לבצע מחקרים בבעלי חיים ו" שדה ניסויים "שמעסיקים רופאים להעריך את ההצלחה של הטכנולוגיה 9, 16,17. למרבה הצער, מחקרי מעבדה נוטים להסתמך על מערכות מודל שמעסיקות את טביעת רגל גדולה, הם מבחינה טכנולוגית מאתגרים לשימוש, ולעתים קרובות מכיל פשוטים קהילות של אחד או לכל היותר כמה מינים לגזור עולם אמיתי פוטנציאלי כלומר 10,18. בהתחשב בכך שbiofilms רובד שיניים מכיל מינים וצורה מרובים בcomplלשעבר זורם סביבת רוק, פיתוח biofilms המכיל אחד או כמה מינים בתקשורת מלאכותית סביר כדי ליצור קהילות שמתנהגות באופן דומה לאלה בתרחיש של עולם אמיתי 10,19. כדי לטפל בזמן, העלות, דרישות הכשרה, ואת אופי הנציג הירוד של מערכות biofilm מודל מעבדה בהשוואה לסביבה בעולם האמיתי, לאחרונה פיתחו מערכת biofilm שמקורן הסביבה 20 (איור 1) תפוקה וגבוהה. יתרונות המערכת מהשימוש ברוק תא ללא במאגר אנושי (CFS) כמו רוק בינוני ולא מטופל ונקווה אדם בקטריאלי המכיל תא (CCS) כבידוד. באופן ייחודי, המערכת משלבת גם טכנולוגית microfluidic, מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal, וטכנולוגיה ניתוח מגוון חיידקי תרבות עצמאית. לפיכך, מערכת המודל הוא רוק שמקורן הסביבה (באמצעות כבידוד לגדול biofilms רבי מינים ב 37 ° C בזורם מעוקר מסנןרוק) וbiofilms האוראלי מכילים מינים (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, ומיני Porphyromonas) בנציג שכיחותם של אלה שנמצאו ברובד supragingival המוקדם 20.
כאשר בהתחשב בכך שעבודה זו מתארת את השימוש במערכת המודל חדש שפותחה, תשומת לב מיוחדת יש לתת למיזוג של מיקרופלואידיקה מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), וטכנולוגיות ניתוח גיוון תרבות עצמאית. האיחוד של טכנולוגיות אלה על ידי קבוצת המחקר שלנו היה מכוון ולא רק מוסיף יכולת תפוקה גבוהה למערכת המודל החדש שפותחה, אלא גם מאפשר לי שאלות שיש לשאול שלא יכולות להיות בקלות לטפל לפני עם מערכות אחרות. ראשית, יש CLSM יתרונות ברורים על פני מיקרוסקופיה המסורתית שכן היא מאפשרת לניתוח תלת-ממדי של biofilms. לעתים קרובות שלא מעריכים, זה חשוב מאוד כbiofilms הוא שנינות הטרוגניתכבוד h להרכב מינים ומיקום המרחבי, כמו גם את התנאים הפיסיולוגיים שהוטל במקומות שונים במרחבי biofilm 6,21. בתיאום עם תוכנה תלת ממדי טיוח ותוכנת ניתוח תמונה, ארכיטקטורת biofilm, יחסים מרחביים בין מיני רכיב, והרג מיקרוביאלית מידה ניתן לנתח 22-24. יכולות כאלה אינן אפשריות באמצעות אור רגיל שמועבר או מיקרוסקופיה epifluorescence. בשלב הבא, מיקרופלואידיקה זכתה לתשומת לב מיוחדת בתחום מיקרוביולוגיה כפי שהיא מאפשרת המחקר של biofilms בתנאים מבוקרים היטב (זרימה, טמפרטורה, pH, וכו '), ורק דורשת כמויות קטנות של 25-27 הנוזלי. כנקודת השוואה, גידול biofilm אוראלי ברוק אנושי בתוך מערכת מודל תא זרימה (מערכת שנחשבת למודל התווך למחקרים רבים biofilm אוראליים לטעון) במשך 20 שעות בספיקה וגזירה דומות לזה שהושגבמערכת microfluidic דורש לפחות 200 מיליליטר, בניגוד ל -800 μl במכשיר microfluidic 28-31. לפיכך, מערכת biofilm מודל microfluidic מאפשרת העיון בחומר מוגבל כמות בתנאים מוגדרים. לבסוף, טכנולוגית pyrosequencing כבר מותאמת בעשור האחרון לדורשת רק כמויות קטנות של חומר לבצע ניתוח קהילה ומספיק תכליתי כדי לשלוט עומק של רצף כדי לקבל את הזהות של מיני biofilm אפילו נדירים. השימוש בטכנולוגיה זו, כגון pyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP), אפשר לשאלות רלוונטיות הנוגעות לאקולוגיה של biofilms לטפל 32,33. שאלות מסוג זה חדורים קשיים בעבר כאשר pyrosequencing לא היה זמין בגלל הזמן והעלויות הנדרשות ליצירת ספריות פלסמיד ונדרשו להפיק נתונים 33,34 צעדים טכנולוגיים ואנליטיות המורכבים. כמובן, יתרון גדול עם ap התרבות העצמאיתגישות, כגון pyrosequencing, היא שמיני חיידקים שלא ניתן לגדל בבידוד בתוך תקשורת מעבדה הקונבנציונלית (מינים ברי קיימא כלומר אבל אינם ראויים לעיבוד חקלאי) ניתן לגדל וזיהו בתוך מערכת המודל והשפע היחסי שלהם בקהילה לכמת 35, 36 . כדי להוסיף נקודת מבט, מוקדם ככל 1963, זיגמונד Socransky מאוחר ההערכה היא כי כ -50% מהחיידקים בחומר המבודדים מנקיק החניכיים הפה האנושי לא יכולים להיות מתורבת באמצעות תנאי גידול מעבדה 37.
מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את הגישה לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים במערכת microfluidic זמינה מסחרי (Bioflux) תחת: נציג תנאים (i) של חלל הפה האנושי ו( ii) עם הרכב מינים ושפע ש דומה לשלט supragingival. יתר על כן, שימוש בשתי תוכנות חופשית ומסחריות, אנו מדגישים biofilm איך בסיסיניתן לגזור אמצעי ארכיטקטורה מנתוני CLSM, עם דגש על גישות לכמת ביומסה biofilm, חספוס, ואת כדאיות (המבוסס על צביעה חי / מת). לבסוף, את הצעדים הנדרשים כדי לקצור חומר biofilm לניתוח גיוון ידי bTEFAP מתוארים.
Protocol
Representative Results
Discussion
נייר שיטות זה מדגיש הנדרש להקמת השלבים הבסיסיים ולהפעיל מערכת microfluidic באופן שיאפשר לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים נגזר מרוק אנושי ונקווה וגדל ב- 25% רוק אנושי ויקווה-מעוקר מסנן. מקבלות גישות לאפיין את biofilm אך יש לזכור כי גישות המתוארות אלה הן טכנולוגיות לשינוי ונוספות כ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ויליאם Nance (אוניברסיטת מישיגן) לעזרה בגיבוש פרוטוקולי צמיחת biofilm וג'ון בטיסטה (Fluxion, סן פרנסיסקו, קליפורניה) לקבלת ייעוץ בנושאים טכנולוגיים הנוגעים למערכת Bioflux. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (NIH: R21DE018820 לAHR) ואוניברסיטת מישיגן קרנות הזנק לAHR
Materials
| SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
| Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| SOFTWARE | ||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | |
| Imaris | Bitplane | |
| Leica SPE | Leica | |
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | |
References
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
- Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
- Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
- Anon, . Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).
- Smith, H., Smith, H., Taylor, J. . Microbial behavior, ‘in vivo’ and ‘in vitro. , 1-29 (1964).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
- McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
- Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
- Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
- Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
- Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
- Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
- Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
- Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
- Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
- Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
- Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
- Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
- Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists’ Association. 85 (4), 256-263 (2011).
- Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
- Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
- Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
- Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
- Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
- Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
- Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).
