ハイスループットの使用<em>インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために>マイクロ流体システム
Summary
この方法の論文の目的は、典型的にはヒト歯肉縁上の歯垢内で識別種を含む多種バイオフィルムの開発のための微小流体システムの使用を説明することである。バイオフィルムのアーキテクチャ、バイオフィルムの生存率、および文化に依存またはカルチャに依存しない解析が強調表示されるための収穫バイオフィルムへのアプローチを記述するための方法。
Abstract
いくつかのハイスループットは、一般に、インビボでの経口バイオフィルム内で検出された多数の種を含む多種バイオフィルムの発達を促進するインビトロ系である。また、代わりに人工のメディアの、栄養源として天然のヒト唾液を使用するシステムは、 インビボでのコミュニティを模倣する細胞およびバイオ固有のプロパティの表現をサポートするために特に望ましい。我々は、ヒト口腔と同様の条件下で、歯垢、歯肉縁上ために、種の組成物に関して、同等である多種の口腔バイオフィルムの開発のための方法を記載する。具体的には、この方法の記事は、市販のマイクロ流体システムは、から誘導される多種の口腔バイオフィルムの発達を促進するように適合され、そしてプール唾液内で成長させることができる方法を説明する。さらに、どのようにシステムの説明はconfocaと組み合わせて使用することができる建築および生存分析のために3-Dバイオフィルム再構成を生成するためのLのレーザ走査型顕微鏡が提示される。 （ 連鎖球菌 、 ナイセリア 、 ベイヨネラ 、 双子菌属 、及びポルフィロモナス含む）マイクロ流体システムにおけるバイオフィルム内で成長する微生物の幅広い多様性を考えると、プロトコルは、さらにサブカルチャーやDNA抽出および分析のためにバイオフィルム細胞を採取する方法を説明した表示されます。微小流体バイオシステムと現在の最先端のデータ分析の両方の限界に対処する。最終的には、この物品は、口腔バイオフィルムの研究を向上させ、マイクロ流体プラットフォームに統合することができる付加的な技術の開発に助けとなるベースライン技術を提供することが想定される。
Introduction
バイオフィルムは、アーキテクチャ面 1,2に集約された細菌の複雑な社会である。これらのコミュニティは、一般的にバイオフィルム2内の互いに対話多数の種が含まれている。オーラルバイオフィルム、最も視覚的に目立たなく歯垢は、ヒトでの永続的な問題と分類学的に多様なマルチ種コミュニティ3の世代での制御されていない開発の成果である。これらの多様なコミュニティの構成要素細菌は彼らのフリーフローティング（プランクトン）の対応4-6より抗菌剤に対する耐性が1,000倍までとすることができる。虫歯や歯周病を引き起こす可能性がこれらの経口バイオフィルムのコミュニティを、治療の失敗は、重大な公衆衛生上の負担な結果になっています。5億以上の米国における年間歯科医のオフィスを訪問し、約1080億ドルを歯周の治療または予防のために、病気や虫歯7。
8 -Smithコンテンツ">" 多くの微生物学者は、自然条件の下での微生物の挙動を研究提唱しているが、それらのいくつかがそう。困難を克服するための彼らの士気は常に実験室の培養での作業の魅力的な容易さによって搾り取っているためです 。」。現在、口腔バイオフィルムの研究はインビボおよびインビトロのアプローチの多様性を用いて行われる、独自の長所と、それぞれが9,10不利。 インビトロでは 、多くの場合、セットアップするのが比較的容易であるが、臨床欠いてモデルバイオシステムを使用近づく/現実世界の関連10,11。 インビボで 、典型的にはヒト口腔環境の特定の局面を再現するが、やはりにより動物とヒトの間で12解剖学、生理学、微生物学および免疫学の違いに制限を受けることができる動物モデル系に依存して接近する13。それは、口腔バイオフィルムに留意すべきであるまた、ヒトのボランティアの口の中にステントに保持されているエナメル質表面上に現像され、このアプローチは、現在、比較的高価であり、労働集約14,15であることができる。最終的には、新規薬剤または口腔ヘルスケアを改善するための技術は、制御された臨床試験の条件の下で11ヒトで試験されている。現在では、新しい経口の医療薬剤を同定し、評価するためのよく使用する手口は、まず潜在的有効性を識別するために実験室での研究を行うことで、その後の動物研究と技術9の成功を評価するために臨床医を採用する「実地試験」を実行、 16,17。残念ながら、実験室での研究は、大面積を占めるモデル系に依存する傾向が使用する技術的に挑戦的であり、しばしば10,18を意味する可能性のある現実世界を導出するために、1つのまたはほとんどの少数の種で簡略化コミュニティを含む。歯垢バイオフィルムはCOMPLに複数の種とフォームが含まれていることを考えると唾液環境を流れるexは、人工培地でつを含むバイオフィルムまたは数種の開発は実際のシナリオ10,19のものと同様に挙動するコミュニティを生成する可能性は低い。時間、コスト、訓練要件、及び実際の環境と比較して、実験室モデルバイオフィルムシステムの貧弱な代表的な性質に対処するために、我々は最近、ハイスループットかつ環境ゲルマンバイオシステム20（ 図1）を開発した。接種材料として培地および未処理のプールされたヒトの細菌細胞を含有する唾液（CCS）などの無細胞のプールされたヒト唾液（CFS）の使用によるシステムの利点。独自に、システムはまた、マイクロ流体技術、共焦点レーザー走査顕微鏡、および文化に依存しない細菌多様性の解析技術を組み合わせた。このように、モデル系は37で、多種のバイオフィルムを成長させるために接種物として唾液を使用して（環境的に密接な関係である 濾過滅菌流れる中で°C唾液）と口腔バイオフィルムは初期の歯肉縁上プラーク20に見られるものの存在量を代表に連鎖球菌 、 ナイセリア 、 ベイヨネラ 、及びポルフィロモナス種を含む種を（）が含まれています。
この作品は、新たに開発したモデルシステムの使用が記載されていることを考慮すると、特に注意は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）マイクロフルイディクス、および文化に依存しない多様性解析技術の融合を考慮しなければならない。私たちの研究グループによるこれらの技術の労働組合は、意図的だったとだけでなく、新たに開発されたモデル系に高スループットの機能を追加するだけでなく、質問は簡単に他のシステムとの前に対処しなかったことを尋ねられることを可能にする。それはバイオフィルムの三次元解析が可能になるように、まず、CLSMは、従来の顕微鏡検査に比べて明らかな利点を有する。バイオフィルムは異質ウィットあるように頻繁に正しく評価されていない、これは非常に重要です。時間種組成と空間位置に対してだけでなく、生理的な条件は、バイオフィルム6,21内の異なる空間的位置に課されている。 3次元レンダリングソフトウェア、画像分析ソフトウェアと協調して、バイオフィルムのアーキテクチャコンポーネント種間の空間的関係、および抗菌死滅の程度は、22〜24を分析することができる。このような能力は、標準的な透過光またはエピ蛍光顕微鏡を使用して可能ではありません。それは慎重に制御された条件（流量、温度、pH値、 など ）の下でバイオフィルムの研究を可能にし、液体のみ25-27の小さなボリュームを必要とする次に、マイクロフルイディクスは、微生物学の分野で特に注目を集めています。達成されたものと同様の流速及びせん断で20時間フローセルモデル系（ほぼ間違いなく、多くの口腔バイオフィルムの研究のための主力モデルと考えられているシステム）内のヒト唾液の経口バイオフィルムの成長の比較点としてマイクロ流体デバイス28〜31に800μlのとは対照的に、マイクロ流体システムにおいて、少なくとも200ミリリットルが必要である。このように、マイクロ流体モデルバイオフィルムシステムは、規定された条件下で数量限定の材料の研究を可能にします。最後に、パイロシーケンシング技術は、社会の分析を実行するために材料を少量しか必要とする過去10年間に最適化され、さらに希少バイオ種の同一性を得るために、配列決定の深さを制御するのに十分な汎用性がありされている。そのような細菌のタグエンコードされたFLXアンプリコンのパイロシーケンシング（bTEFAP）としてこの技術の使用は、32,33の対処すべきバイオフィルムの生態に関する適切な質問を可能にした。このような質問は、ピロシーケンスが原因で、プラスミドライブラリやデータ33,34を引き出すために必要な複雑な技術や分析の手順を作成するために必要な時間とコストのため利用できませんでした、過去の困難を吹き込ま。もちろん、文化に依存しないAPとの大きな利点従来の実験用培地（ すなわち 、生存するが、非耕作種）内で分離して成長させることができない細菌種が成長し、識別されたモデルシステム内で、コミュニティ内での相対的な存在量は35、36を定量することができるようにパイロシーケンシングなどproachesを、ある。視点を追加するには、早くも1963年のように、後半ジークムントSocranskyはヒト口腔歯肉裂け目から単離された物質中の細菌の約50％が実験室の成長条件37を用いて培養することができなかったと推定。
その種組成と豊かさと人間の口腔の（I）の条件の代表と、（ii）：このメソッド紙の目的は、下に市販のマイクロ流体（Bioflux）システムの経口マルチ種のバイオフィルムを開発するためのアプローチを説明することである歯肉縁上プラークに匹敵する。さらに、両方のフリーウェアや商用ソフトウェアを使用して、私たちはどのように基本的なバイオフィルムを強調アーキテクチャ対策がバイオフィルムのバイオマス、粗さ、および生存を定量化するためのアプローチに焦点を当て、CLSMデータから導出することができる（ライブ/デッド染色に基づく）。最後に、bTEFAPによって多様性解析のためのバイオ材料を収穫するために必要な手順が記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は紙はセットアップに必要な基本的な手順を強調し、プールしたヒト唾液由来し、フィルター滅菌25％のプールされたヒトの唾液中で成長経口マルチ種のバイオフィルムの開発を可能にするような方法でマイクロ流体システムを実行します。バイオフィルムを特徴付けるためのアプローチが示されているが、これらの記載されるアプローチは、例えば、汚れやラベルを導入すること?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、バイオフィルムの成長プロトコルとジョン·バッティスタ（流動、サンフランシスコ、カリフォルニア州）Biofluxシステムに関連する技術的な問題についてのアドバイスを処方するのに助けをウィリアムナンス（ミシガン大学）を感謝。 AHRへとミシガン大学の起動資金：この作品は、国立衛生研究所（AHRにR21DE018820 NIH）によってサポートされていました
Materials
| SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
| Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| SOFTWARE | ||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | |
| Imaris | Bitplane | |
| Leica SPE | Leica | |
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | |
References
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