Utilisation d'un haut-débit<em> In Vitro</em> Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

Summary

Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.

Abstract

Il ya peu à haut débit dans des systèmes in vitro qui facilitent le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent de nombreuses espèces souvent détectés dans les biofilms buccaux in vivo. En outre, un système qui utilise la salive humaine naturelle comme source nutritif, au lieu d'un milieu artificiel, est particulièrement souhaitable afin de soutenir l'expression des propriétés cellulaires et spécifiques à biofilm qui imitent les communautés in vivo. Nous décrivons une méthode pour le développement de multiples espèces de biofilms oraux qui sont comparables, par rapport à la composition spécifique, de la plaque dentaire supragingival, dans des conditions semblables à la cavité buccale humaine. Plus précisément, cet article de méthodes décrira comment un système microfluidique disponible dans le commerce peut être adaptée pour faciliter le développement de multi-espèces provenant de biofilms buccaux et cultivé au sein de la salive commun. En outre, une description de la façon dont le système peut être utilisé en conjonction avec un confocal laser microscope à balayage pour générer 3-D reconstructions du biofilm pour analyses architecturales et de viabilité sera présenté. Compte tenu de la grande diversité des micro-organismes qui se développent au sein des biofilms dans le système microfluidique (y compris Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella et Porphyromonas), un protocole sera également présenté décrivant comment récolter les cellules du biofilm pour plus sous-culture ou l'extraction d'ADN et d'analyse. Les limites à la fois le système de biofilm microfluidique et les analyses de données actuelles sur l'état de l'art seront abordés. En fin de compte, il est prévu que cet article va fournir une technique de référence qui permettra d'améliorer l'étude des biofilms buccaux et d'aider dans le développement de technologies supplémentaires qui peuvent être intégrés à la plate-forme microfluidique.

Introduction

Les biofilms sont architecturalement communautés complexes de bactéries qui sont regroupés sur des surfaces ^1. Ces communautés contiennent typiquement de nombreuses espèces qui interagissent avec une autre à l'intérieur du biofilm ^2. Biofilms buccaux, le plus remarquable à la vue étant la plaque dentaire, sont un problème persistant chez les humains et les résultats de leur développement incontrôlé dans la génération de taxonomique diverses communautés multi-espèces ^3. Les bactéries composant de ces diverses communautés peuvent être jusqu'à 1000 fois plus résistants aux antimicrobiens que leurs homologues (planctoniques) flottant librement ^4-6. Défaut de traiter ces communautés des biofilms oraux, qui peuvent causer la carie dentaire et les maladies parodontales, a donné lieu à un fardeau de santé publique important: plus de 500 millions de visites au bureau de dentiste par an aux États-Unis et un d'environ 108 milliards de dollars pour traiter ou prévenir parodontale les maladies et les caries dentaires ^7.

contenu ">" Alors que de nombreux microbiologistes préconisent d'étudier le comportement microbien dans les conditions naturelles, peu d'entre eux le font. Ce est parce que leur moral pour surmonter les difficultés est constamment sapé par la facilité attractif de travailler avec des cultures de laboratoire. "-Smith ^8.

À l'heure actuelle, la recherche de biofilm orale est effectuée en utilisant une variété de in vivo et in vitro des approches, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients ^9,10. Approches in vitro utilisent souvent modèle systèmes de biofilm qui sont relativement faciles à mettre en place, mais peuvent manquer clinique / monde réel pertinence ^10,11. In vivo approches reposent généralement sur ​​des systèmes de modèles animaux qui peuvent reproduire certains aspects de l'environnement buccal humain, mais encore une fois souffrir de limitations dues à des différences dans l'anatomie, la physiologie, de la microbiologie et de l'immunologie entre animaux et humains ^{12, 13.} Il convient de noter que les biofilms orauxpeuvent également être développés sur des surfaces d'émail détenus dans un stent dans la bouche des volontaires humains, mais cette approche est actuellement relativement coûteux et main-d'œuvre ^14,15. En fin de compte, de nouveaux agents ou des technologies pour améliorer la santé bucco-dentaire sont testés chez l'homme dans des conditions d'essais cliniques contrôlés ^11. À l'heure actuelle, un modus operandi souvent utilisée pour identifier et évaluer de nouveaux agents de santé bucco-dentaire est d'abord de réaliser des études de laboratoire pour discerner efficacité potentielle, puis de réaliser des études sur les animaux et les «essais sur le terrain» qui emploient des cliniciens pour évaluer le succès de la technologie ^{9, 16,17.} Malheureusement, les études de laboratoire ont tendance à se appuyer sur des systèmes modèles qui occupent une grande empreinte, sont technologiquement difficile à utiliser, et contiennent souvent simplifiées communautés de l'un ou tout au plus quelques espèces de tirer le potentiel signifiant ^10,18 monde réel. Étant donné que les biofilms de la plaque dentaire contiennent plusieurs espèces et la forme dans un complex coule milieu salivaire, le développement de biofilms qui contiennent une ou quelques espèces dans les médias artificielle est peu probable pour générer communautés qui se comportent d'une manière similaire à celles d'un scénario réel ^10,19. Pour faire face à l'époque, le coût, les besoins de formation, et de la nature représentant pauvres de systèmes de biofilm modèle de laboratoire par rapport à l'environnement dans le monde réel, nous avons récemment développé un débit élevé et germane environnement système de biofilm ²⁰ (Figure 1). Le système bénéficie de l'utilisation de la salive acellulaire groupée humaine (SCF) en commun la salive contenant des cellules bactérienne humaine à moyen et non traitée (CCS) comme inoculum. Unique, le système combine également la technologie microfluidique, un confocal à balayage laser microscope, et indépendante de la culture bactérienne diversité technologie d'analyse. Ainsi, le système de modèle de l'environnement est germane (salive en utilisant comme inoculum pour la croissance des biofilms multi-espèces à 37 ° C dans le filtre stérilisé coulesalive) et les biofilms buccaux contiennent des espèces (y compris Streptococcus, Neisseria, Veillonella et Porphyromonas espèces) dans l'abondance représentant de ceux trouvés au début de la plaque dentaire supra ^20.

Lorsque l'on considère que ce travail décrit l'utilisation du système de modèle nouvellement développé, une attention particulière doit être accordée à la fusion d'une confocal microscope à balayage laser (CLSM) microfluidique, et les technologies d'analyse de la diversité de la culture indépendante. L'union de ces technologies par notre groupe de recherche était intentionnelle et non seulement ajoute une capacité à haut débit pour le système modèle nouvellement développé, mais permet aussi des questions à poser qui ne pouvaient pas être facilement résolus avant avec d'autres systèmes. Tout d'abord, CLSM a des avantages distincts sur la microscopie classique car elle permet l'analyse tridimensionnelle de biofilms. Souvent incompris, ce est extrêmement important que les biofilms sont esprit hétérogèneh qui concerne la composition des espèces et la position spatiale ainsi que les conditions physiologiques imposées à différents emplacements spatiaux dans le biofilm ^6,21. De concert avec le logiciel de rendu en trois dimensions et le logiciel d'analyse d'image, l'architecture du biofilm, les relations spatiales entre les espèces qui le composent, et l'étendue de l'abattage antimicrobien peut être analysée ^22-24. Ces capacités ne sont pas possibles en utilisant la norme lumière transmise ou microscopie à épifluorescence. Ensuite, la microfluidique a attiré l'attention notamment dans le domaine de la microbiologie car elle permet l'étude des biofilms dans des conditions soigneusement contrôlées (débit, température, pH, etc.) et ne nécessite faibles volumes de liquide ^25-27. Comme point de comparaison, la croissance d'une biofilm orale dans la salive humaine dans un système de modèle de cellule d'écoulement (un système qui est sans doute considéré comme le modèle de base pour de nombreuses études de biofilm orale) pendant 20 heures à un débit et de cisaillement similaire à celui atteintdans un système microfluidique nécessite au moins 200 ml, au lieu de 800 ul dans le dispositif microfluidique ^28-31. Ainsi, un système modèle de biofilm microfluidique permet l'étude de la matière de quantité limitée dans des conditions définies. Enfin, la technologie de pyroséquençage a été optimisée dans la dernière décennie d'exiger que de petites quantités de matière pour effectuer une analyse de la communauté et est suffisamment polyvalent pour contrôler la profondeur de séquençage pour obtenir l'identité des espèces de biofilm même rares. L'utilisation de cette technologie, comme bactérienne tag codé FLX amplicon pyroséquençage (bTEFAP), a permis de questions pertinentes concernant l'écologie des biofilms à aborder ^32,33. Ces questions imprégnés des difficultés dans le passé, lorsque pyroséquençage ne ​​était pas disponible en raison du temps et des coûts nécessaires pour créer des bibliothèques de plasmides et les étapes technologiques et analytiques complexes nécessaires pour obtenir des données ^33,34. Bien sûr, un grand avantage avec la culture indépendante apapproches, telles que pyroséquençage, ce est que les espèces de bactéries qui ne peuvent pas être cultivés en isolement au sein des milieux de laboratoire conventionnel (espèces à-dire viables mais non cultivables) peuvent être cultivées et identifiés dans le système de modèle et leur abondance relative dans la communauté quantifiés ^{35, 36} . Pour ajouter perspective, dès 1963, la fin de Sigmund Socransky estime qu'environ 50% des bactéries isolées à partir de matériel de la crevasse gingivale humain par voie orale n'a pas pu être mis en culture en utilisant des conditions de croissance de ³⁷ laboratoire.

L'objectif de ce document sur les méthodes est de décrire l'approche de développer biofilms multi-espèces orales dans un système microfluidique disponible dans le commerce (Bioflux) en vertu: (i) des conditions représentatives de la cavité buccale humaine et (ii) avec une composition des espèces et l'abondance que est comparable à la plaque dentaire supra. En outre, en utilisant les logiciels freeware et commerciale, nous soulignons biofilm faire de basemesures d'architecture peuvent être tirées des données CLSM, avec un accent sur les approches pour quantifier la biomasse biofilm, la rugosité et la viabilité (basés sur direct coloration / Dead). Enfin, les mesures nécessaires pour récolter la matière biofilm pour l'analyse de la diversité en bTEFAP sont décrits.

Protocol

Le protocole de collecte de salive décrit ici a été examiné par l'Université de l'Institutional Review Board du Michigan pour la recherche sur des sujets humains. NOTE: En ce qui concerne les examens institutionnels pour le travail sur des sujets humains de ce type, des arrangements préalables et autorisations doivent être glanés au cours de l'établissement d'accueil. En particulier, selon l'établissement, la CISR ou d'approbation d'éthique pourraient avoir besoin d'êtr…

Representative Results

Rendu 3D des biofilms Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 3. Un outil utile dans les logiciels de Imaris est l'option à examiner chaque tranche de la pile de biofilm recueillies et de les combiner pour créer des reconstructions tridimensionnelles. En outre, les effets d'ombrage artificiels peuvent être ajoutés pour aider à interpréter visuellement des structures tridimensionnelles. Les biofilms rendus peuvent…

Discussion

Ce document met en évidence les méthodes les étapes de base nécessaires pour configurer et exécuter un système microfluidique de manière à permettre le développement de biofilms multi-espèces orales provenant de la salive humaine regroupées et cultivés dans stérilisée par filtration 25% mis en commun la salive humaine. Approches pour caractériser le biofilm sont donnés, mais il faut se rappeler que ces approches décrites sont modifiables et technologies supplémentaires telles que, par exemple, des tach…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)