Verwendung eines Hochdurchsatz-<em> In-vitro-</em> Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Summary

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Abstract

Es gibt nur wenige Hochdurch in vitro-Systeme, die die Entwicklung von Multi-Spezies in Biofilmen zahlreiche Arten üblicherweise in in vivo oral Biofilmen detektiert enthalten erleichtern. Darüber hinaus ist ein System, das natürliche humane Speichel verwendet als Nährstoffquelle, statt künstlicher Medien, um die Expression von zellulären und Biofilm-spezifische Eigenschaften, die in vivo nachahmen Gemeinschaften unterstützt besonders wünschenswert. Wir beschreiben ein Verfahren für die Entwicklung von Mehrarten oralen Biofilmen, die vergleichbar sind, mit Bezug auf die Artenzusammensetzung, um Zahnbelag supragingivalen, unter ähnlichen Bedingungen wie die menschliche Mundhöhle. Genauer gesagt, wird diese Methoden Artikel beschreiben, wie ein im Handel erhältlicher Mikrofluidsystem kann angepasst werden, um die Entwicklung von Multi-Spezies orale Biofilme abgeleitet erleichtern und innerhalb gepoolt Speichel gezüchtet. Darüber hinaus kann eine Beschreibung, wie das System in Verbindung mit einem confoca verwendet werdenl Laserabtastmikroskop zur 3-D Biofilm Rekonstruktionen für architektonische und Lebensfähigkeit Analysen erzeugen vorgestellt. Angesichts des breiten Vielfalt von Mikroorganismen, die in Biofilmen in der mikrofluidischen Systems (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella und Porphyromonas) wachsen, wird ein Protokoll auch beschreiben, wie Sie die Biofilm-Zellen für die weitere Subkultur oder DNA-Extraktion und Analyse Ernte vorgelegt werden. Die Grenzen sowohl der Mikrofluidik Biofilm System und die aktuellen State-of-the-art Datenanalysen angesprochen. Letztlich ist es vorstellbar, dass dieser Artikel eine Basistechnik, die die Untersuchung der oralen Biofilmen verbessern und helfen bei der Entwicklung von weiteren Technologien, die mit dem Mikrofluid-Plattform integriert werden können, bereitzustellen.

Introduction

Biofilme sind architektonisch komplexe Gemeinschaften von Bakterien, die auf Oberflächen ¹ zusammengefasst sind. Diese Gemeinschaften enthalten typischerweise zahlreiche Arten, die miteinander innerhalb des Biofilms ² interagieren. Oral Biofilme, die optisch auffälliger als Zahnbelag, sind ein ständiges Problem bei Menschen und ihre unkontrollierte Entwicklung führt zur Erzeugung von taxonomisch diverse Mehrartengemeinschaften ^3. Die Komponente Bakterien dieser verschiedenen Gemeinden können bis zu 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika als ihre freischwebenden (Plankton) Gegen ^4-6 sein. Die Nichtbeachtung dieser mündlichen Biofilm Gemeinden, die Karies und Parodontitis verursachen können, zu behandeln, hat zu einer erheblichen Belastung der öffentlichen Gesundheit ergeben: mehr als 500 Millionen Besuche in der Zahnarztpraxis pro Jahr in den USA, und ein etwa 108 Milliarden Dollar zur Behandlung oder Vorbeugung von Zahnfleisch Erkrankung und Karies ^7.

Inhalt ">" Während viele Mikrobiologen befürworten Studium mikrobiellen Verhalten unter natürlichen Bedingungen, einige von ihnen tun. Das ist, weil ihre Moral für die Überwindung der Schwierigkeiten wird ständig von den attraktiven einfache Arbeit mit Laborkulturen. "-Smith ⁸ geschwächt.

Derzeit wird oral Biofilm-Forschung mit einer Vielzahl von in vivo und in vitro Ansätzen durchgeführt, benachteiligt jede mit ihren eigenen Vorteile und ^9,10. In-vitro-Ansätze verwenden oft Modell Biofilmsystemen, die relativ einfach zu installieren sind, aber klinische fehlt / realen Welt Relevanz ^10,11. In-vivo-Ansätze bei Tiermodellsysteme, die bestimmte Aspekte der menschlichen Mundraum aufgrund der Unterschiede in Anatomie, Physiologie, Mikrobiologie und Immunologie zwischen Tieren vermehren kann, aber wiederum leiden unter Einschränkungen und Menschen ¹² der Regel ^{verlassen, 13.} Es sollte angemerkt werden, dass die orale Biofilmekann auch auf Email-Oberflächen in einem Stent innerhalb der Mündungen Probanden gehalten entwickelt werden, aber dieser Ansatz ist derzeit relativ aufwendig und arbeitsintensiv, ^14,15. Letztlich werden neue Wirkstoffe und Technologien zur Verbesserung der Gesundheitsversorgung Mund beim Menschen unter kontrollierten klinischen Studie Bedingungen ¹¹ getestet. Derzeit ist eine häufig verwendete Vorgehensweise zur Ermittlung und Bewertung neuer Zahnpflegemittel, zuerst durchführen Laborstudien zur möglichen Wirksamkeit zu erkennen, und führen Sie dann Tierversuche und "Feldversuche", die Ärzte verwenden, um den Erfolg der Technologie ^{9 auszuwerten, 16,17.} Leider neigen Laborstudien an Modellsystemen, die einen großen Platzbedarf besetzen verlassen, sind technologisch anspruchsvolle zu bedienen, und enthalten oft vereinfacht Gemeinden eine oder höchstens einige wenige Arten, potenzielle reale Bedeutung ^10,18 abzuleiten. Da Zahnbelag Biofilmen enthalten mehrere Arten und Form in einem komplEx fließt Speichelmilieu, die Entwicklung von Biofilmen, die man selbst oder einige Arten in künstlichen Medien ist unwahrscheinlich, dass Gemeinden, die in einer ähnlichen Weise wie in einem realen Szenario ^10,19 verhalten zu generieren. Um die Zeit, Kosten, Ausbildungsanforderungen, und die Armen Repräsentativität der Labormodell Biofilmsystemen im Vergleich zur realen Umgebung anzusprechen, haben wir vor kurzem eine Hochdurchsatz und umwelt Germane Biofilmsystem ²⁰ (Abbildung 1). Diese Systeme profitieren von der Verwendung von zellfreien gepoolten menschlichen Speichel (CFS) als Medium und unbehandeltem menschlichem Mischbakterienzellen enthaltenden Speichel (CCS) als Inokulum. Einzigartig ist, verbindet das System auch Mikrofluidik-Technologie, einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop und kulturunabhängige bakterielle Vielfalt Analysetechnik. Somit ist die Modellsystem umwelt Germane (mit Speichel als ein Inokulum zum Multispezies Biofilme bei 37 wachsen ° C in filtersterilisiert fließtSpeichel) und die orale Biofilme enthalten Arten (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella und Porphyromonas-Spezies) in Häufigkeiten, die den in frühen supragingivale Plaque ²⁰ gefunden.

Wenn man bedenkt, dass diese Arbeit beschreibt den Einsatz des neu entwickelten Modellsystem, muss besonderes Augenmerk auf die Zusammenlegung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) Mikrofluidik und kulturunabhängige Vielfalt Analysetechnologien geben. Die Vereinigung dieser Technologien von unserer Arbeitsgruppe beabsichtigt war und nicht nur fügt eine Hochdurchsatzfähigkeit des neu entwickelten Modellsystem, sondern erlaubt auch die Fragen, die gestellt werden, die nicht leicht adressiert werden, bevor mit anderen Systemen werden. Erstens hat CLSM deutliche Vorteile gegenüber traditionellen Mikroskopie, wie es für die dreidimensionale Analyse von Biofilmen. Oft unbeachtet, dies ist äußerst wichtig, da Biofilme heterogene Witzh bezüglich Artenzusammensetzung und räumliche Lage sowie die physiologischen Bedingungen an unterschiedlichen räumlichen Stellen innerhalb des Biofilms ^6,21 auferlegt. Zusammen mit dreidimensionalen Rendering-Software und Bildanalyse-Software, die Biofilmarchitektur räumlichen Beziehungen zwischen Komponentenarten, und das Ausmaß der antimikrobiellen Abtötung analysiert ^22-24 werden. Solche Fähigkeiten sind nicht mit Standard-Durchlicht oder Epifluoreszenzmikroskopie. Weiter hat Mikrofluidik insbesondere Aufmerksamkeit erregt auf dem Gebiet der Mikrobiologie es ermöglicht die Untersuchung von Biofilmen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen (Durchfluss, Temperatur, pH, etc.) und erfordert nur kleine Flüssigkeitsvolumina ^25-27. Als Vergleichspunkt, Aufwachsen einer oralen Biofilm im menschlichen Speichel innerhalb einer Durchflußzelle Modellsystem (ein System, die wohl als die Hauptstütze Modell für viele oral Biofilm Studien wird) für 20 h bei einer ähnlichen Strömungsrate und Scher wie diejenige erreichtin einem mikrofluidischen System erfordert mindestens 200 ml, im Gegensatz zu 800 & mgr; l in der mikrofluidischen Vorrichtung ^28-31. Auf diese Weise ermöglicht ein Mikrofluidik-Modell Biofilmsystem das Studium der Menge begrenzte Material unter definierten Bedingungen. Schließlich hat Pyrosequenzierungstechnologie im letzten Jahrzehnt optimiert, dass nur geringe Mengen an Material erfordern, um eine Gemeinschaft Analyse durchzuführen, und ist vielseitig genug, um Tiefe von der Ablaufsteuerung, um die Identität auch seltene Biofilmspezies erhalten. Der Einsatz dieser Technologie, wie bakterielle Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) hat für relevante Fragen der Ökologie von Biofilmen dürfen angesprochen ^32,33 werden. Solche Fragen durchdrungen Schwierigkeiten in der Vergangenheit, wenn Pyrosequenzierung war nicht verfügbar, da der benötigten Zeit und Plasmid-Bibliotheken und die komplexen technischen und Analyseschritte erforderlich, um Daten abzuleiten ^33,34 verursachten Kosten. Natürlich ist ein großer Vorteil, mit kulturunabhängige apAnsätze, wie Pyrosequenzierung, ist, dass die Bakterienspezies, die nicht isoliert innerhalb der üblichen Labormedien (dh lebensfähigen, aber nicht-kultivierbaren Arten) gezüchtet werden können, können gezüchtet und identifiziert innerhalb der Modellsystem und ihre relative Häufigkeit in der Community quantitativ ^{35, 36} . Um Sicht bereits 1963 hinzufügen schätzte die späten Sigmund Socransky dass etwa 50% der Bakterien im Material von der menschlichen Mund Sulkus isoliert nicht mit Laborwachstumsbedingungen ³⁷ kultiviert werden.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, Methoden Beschreibung des Ansatzes zur oralen Multi-Spezies-Biofilmen in einem handelsüblichen Mikrofluid (BIOFLUX) Systems unter sich bilden: (i) Bedingungen repräsentativ für die menschliche Mundhöhle und (ii) mit einem Artenzusammensetzung und Fülle, ist vergleichbar mit supragingivale Plaque. Darüber hinaus verwenden sowohl Freeware und kommerzielle Software, markieren wir, wie Grund BiofilmArchitektur Maßnahmen von CLSM Daten abgeleitet werden, wobei der Schwerpunkt auf Ansätze zur Biofilm Biomasse, Rauheit, und Lebensfähigkeit zu quantifizieren (basierend auf Live / Dead-Färbung). Schließlich werden die erforderlich ist, um Biofilm Material für Vielfalt Analyse bTEFAP ernten Schritten beschrieben.

Protocol

Die hier beschriebene Speichelentnahme Protokoll wurde von der University of Michigan Institutional Review Board für Menschenversuch überprüft. HINWEIS: Im Hinblick auf die institutionelle Bewertungen für menschliche Subjekt der Arbeit dieser Art sollten nach vorheriger Vereinbarung und Berechtigungen von der Gasthochschule sammelte werden. Insbesondere in Abhängigkeit von der Institution, IRB oder Ethik Genehmigung Möglicherweise müssen gesucht und genehmigt werden, bevor Speichelentnahme aus Freiwilligen…

Representative Results

3D-Rendering von Biofilmen Repräsentative Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Ein nützliches Werkzeug in Imaris Software ist die Möglichkeit, jede Scheibe des gesammelten Biofilm Stapel zu untersuchen und zu kombinieren, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erstellen. Zusätzlich können künstliche Abschattungseffekte hinzugefügt werden visuell zur Interpretation dreidimensionalen Strukturen. Die erbrachten Biofilmen kann in jede Richtung mit unte…

Discussion

Diese Methodenpapier hebt die grundlegenden Schritte zur Einrichtung erforderlich und führen Sie ein Mikrofluidsystem in einer Weise, die für die Entwicklung von oralen Multi-Spezies-Biofilme aus gepoolten menschlichen Speichel abgeleitet und in filtersterilisiert 25% gepoolten menschlichen Speichel wachsen lassen. Ansätze, um den Biofilm zu charakterisieren sind, gegeben, aber es sollte daran erinnert werden, dass diese beschriebenen Ansätze modifizierbar sind und zusätzliche Technologien, wie beispielsweise Fleck…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)