एक उच्च throughput का प्रयोग करें<em> इन विट्रो</em> Microfluidic प्रणाली ओरल बहु प्रजातियों Biofilms विकसित करने के लिए
Summary
इस तरीके से कागज के लक्ष्य को आम तौर पर मानव supragingival दंत पट्टिका में पहचान की प्रजातियों होते हैं कि बहु प्रजातियों biofilms के विकास के लिए एक microfluidic प्रणाली के उपयोग का वर्णन करने के लिए है। तरीके biofilm वास्तुकला, biofilm व्यवहार्यता, और डाला जाता संस्कृति पर निर्भर या संस्कृति स्वतंत्र विश्लेषण के लिए फसल biofilm के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए।
Abstract
आमतौर पर इन विवो मौखिक biofilms भीतर का पता चला कई प्रजातियों होते हैं कि बहु प्रजातियों biofilms के विकास की सुविधा है, जो इन विट्रो प्रणालियों में कुछ उच्च throughput कर रहे हैं। इसके अलावा, बजाय कृत्रिम मीडिया की, पोषक तत्व स्रोत के रूप में प्राकृतिक मानव लार का उपयोग करता है कि एक प्रणाली है, इन विवो समुदायों कि नकल सेलुलर और biofilm से विशिष्ट गुणों की अभिव्यक्ति का समर्थन करने के क्रम में विशेष रूप से वांछनीय है। हम मानव मौखिक गुहा के समान शर्तों के तहत, दंत पट्टिका supragingival करने, जाति की संरचना करने के लिए सम्मान के साथ, तुलना कर रहे हैं कि बहु प्रजातियों मौखिक biofilms के विकास के लिए एक विधि का वर्णन। विशेष रूप से, इस तरीके लेख एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic प्रणाली से निकाली गई बहु प्रजातियों मौखिक biofilms के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए अनुकूलित और जमा लार के भीतर उगाया जा सकता है कि कैसे का वर्णन करेंगे। इसके अलावा, कैसे प्रणाली का वर्णन के एक confoca साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैएल लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन प्रस्तुत किया जाएगा वास्तु और व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए 3-डी biofilm पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए। (स्ट्रेप्टोकोकस, नेइसेरिया, Veillonella, Gemella, और Porphyromonas सहित) microfluidic प्रणाली में biofilms के भीतर हो जाना कि सूक्ष्मजीवों की व्यापक विविधता को देखते हुए, एक प्रोटोकॉल भी आगे उपसंस्कृति या डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए biofilm कोशिकाओं फसल के लिए कैसे का वर्णन प्रस्तुत किया जाएगा। microfluidic biofilm प्रणाली और वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक डेटा का विश्लेषण दोनों की सीमाओं को संबोधित किया जाएगा। अंत में, यह इस लेख मौखिक biofilms के अध्ययन में सुधार और microfluidic मंच के साथ एकीकृत किया जा सकता है कि अतिरिक्त प्रौद्योगिकियों के विकास में सहायता करेगा कि एक आधारभूत तकनीक प्रदान करेगा कि कल्पना की है।
Introduction
Biofilms वास्तुकला सतहों एक पर एकत्रित कर रहे हैं कि बैक्टीरिया की जटिल समुदायों कर रहे हैं। इन समुदायों के लिए आम तौर पर biofilm दो में एक-दूसरे के साथ बातचीत है कि कई प्रजातियों के होते हैं। ओरल biofilms, सबसे नेत्रहीन विशिष्ट किया जा रहा दंत पट्टिका, एक मानव में लगातार समस्या और श्रेणी विभाजन के विविध बहु प्रजातियों समुदायों 3 की पीढ़ी में उनके अनियंत्रित विकास के परिणाम हैं। इन विविध समुदायों के घटक बैक्टीरिया उनके मुक्त अस्थायी (planktonic) समकक्षों 4-6 से antimicrobials के लिए प्रतिरोधी 1000 गुना तक हो सकता है। अमेरिका में प्रतिवर्ष दंत चिकित्सक कार्यालय में 500 मिलियन से अधिक का दौरा, और एक लगभग $ 108,000,000,000 के इलाज या periodontal को रोकने के लिए: दंत क्षय और periodontal रोग का कारण बन सकता है, जो इन मौखिक biofilm समुदायों का इलाज करने में विफलता, एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ में बदल गया है रोग और दंत क्षय 7।
कठिनाइयों पर काबू पाने के लिए उनके मनोबल लगातार प्रयोगशाला संस्कृतियों के साथ काम करने का आकर्षक आसानी। "8 -Smith द्वारा sapped है क्योंकि सामग्री"> "कई सूक्ष्म जीव विज्ञानियों प्राकृतिक परिस्थितियों में माइक्रोबियल व्यवहार का अध्ययन की वकालत करते हैं, उनमें से कुछ ऐसा करते हैं। यह वह जगह है।वर्तमान में, मौखिक biofilm अनुसंधान में विवो की और इन विट्रो दृष्टिकोण में एक किस्म का उपयोग किया जाता है, अपने स्वयं के लाभ के साथ और प्रत्येक 9,10 नुकसान। इन विट्रो अक्सर स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं लेकिन नैदानिक की कमी हो सकती है कि मॉडल biofilm सिस्टम का उपयोग दृष्टिकोण / वास्तविक दुनिया प्रासंगिकता 10,11। में vivo दृष्टिकोण आम तौर पर मानव मौखिक पर्यावरण के कुछ पहलुओं को पुन: पेश है, लेकिन फिर से सीमाओं से ग्रस्त होने के कारण पशुओं के बीच शरीर रचना विज्ञान, शरीर विज्ञान, सूक्ष्म जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी में मतभेद और 12 मनुष्य हो सकता है कि पशु मॉडल प्रणाली पर भरोसा करते हैं, 13। यह मौखिक biofilms कि ध्यान दिया जाना चाहिएयह भी मानव स्वयंसेवकों के मुंह के भीतर एक स्टेंट में आयोजित तामचीनी सतहों पर विकसित की है, लेकिन इस दृष्टिकोण वर्तमान में अपेक्षाकृत महंगी और श्रम प्रधान 14,15 किया जा सकता है। अंत में, उपन्यास एजेंट या मौखिक स्वास्थ्य सेवा में सुधार के लिए प्रौद्योगिकियों नियंत्रित नैदानिक परीक्षण शर्तों 11 के तहत मानव में परीक्षण कर रहे हैं। वर्तमान में, नए मौखिक स्वास्थ्य सेवा एजेंटों की पहचान करने और मूल्यांकन के लिए एक बार इस्तेमाल किया काम करने का ढंग पहली प्रयोगशाला अध्ययन संभावित प्रभावकारिता विचार, और फिर जानवरों के अध्ययन और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में 9 की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए चिकित्सकों को काम पर कि "क्षेत्र परीक्षण" प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है, 16,17। दुर्भाग्य से, प्रयोगशाला अध्ययन के एक बड़े पदचिह्न पर कब्जा कि मॉडल प्रणाली पर भरोसा करते हैं, का उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौती दे रहे हैं, और अक्सर 10,18 अर्थ संभावित वास्तविक दुनिया प्राप्त करने के लिए कुछ प्रजातियों में से एक या अधिक से अधिक समुदायों सरलीकृत होते हैं। दंत पट्टिका biofilms एक compl में कई प्रजातियों और फार्म में होते हैं यह देखते हुए किपूर्व कृत्रिम मीडिया एक वास्तविक दुनिया परिदृश्य 10,19 में उन लोगों के लिए एक समान तरीके से व्यवहार करते हैं कि समुदायों को उत्पन्न करने की संभावना नहीं है में एक होते हैं कि biofilms या कुछ प्रजातियों के विकास, लार परिवेश बह। समय, लागत, प्रशिक्षण आवश्यकताओं, और वास्तविक दुनिया पर्यावरण की तुलना में प्रयोगशाला मॉडल biofilm प्रणालियों के गरीब प्रतिनिधि प्रकृति का पता करने के लिए, हमने हाल ही में एक उच्च throughput और पर्यावरण की दृष्टि से सार्थक biofilm प्रणाली 20 (चित्रा 1) विकसित की है। एक inoculum के रूप में मध्यम और इलाज जमा मानव बैक्टीरिया कोशिका युक्त लार (सीसीएस) के रूप में सेल मुक्त जमा मानव लार (सीएफएस) के उपयोग से सिस्टम को लाभ। विशिष्ट, इस प्रणाली को भी microfluidic प्रौद्योगिकी, एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग, और संस्कृति स्वतंत्र बैक्टीरियल विविधता विश्लेषण प्रौद्योगिकी को जोड़ती है। इस प्रकार, मॉडल प्रणाली एक inoculum 37 में बहु प्रजातियों biofilms विकसित करने के रूप में पर्यावरण की दृष्टि से सार्थक (का उपयोग कर लार है फिल्टर निष्फल बह में सी °लार) और मौखिक biofilms जल्दी supragingival पट्टिका 20 में पाए जाने वाले के abundances प्रतिनिधि में स्ट्रेप्टोकोकस, नेइसेरिया, Veillonella, और Porphyromonas प्रजातियों सहित प्रजातियों () होते हैं।
इस काम के नव विकसित मॉडल प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है कि जब विचार, विशेष रूप से ध्यान देने की एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLSM) microfluidics के एकीकरण, और संस्कृति स्वतंत्र विविधता विश्लेषण प्रौद्योगिकियों को दिया जाना चाहिए। हमारे शोध समूह द्वारा इन प्रौद्योगिकियों का मिलन जानबूझकर किया गया था और न केवल नव विकसित मॉडल प्रणाली के लिए एक उच्च throughput क्षमता कहते हैं, लेकिन यह भी सवाल आसानी से अन्य प्रणालियों के साथ पहले संबोधित नहीं किया जा सकता है कि कहा जा करने की अनुमति देता है। यह biofilms के तीन आयामी विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के रूप में सबसे पहले, CLSM पारंपरिक माइक्रोस्कोपी से अधिक अलग फायदे हैं। Biofilms विषम बुद्धि के रूप में अक्सर नाचीज, यह अत्यंत महत्वपूर्ण हैएच जाति की संरचना और स्थानिक स्थिति के लिए सम्मान के साथ-साथ शारीरिक स्थितियों biofilm 6,21 के भीतर विभिन्न स्थानिक स्थानों पर लगाया जा रहा है। तीन आयामी प्रतिपादन सॉफ्टवेयर और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, biofilm वास्तुकला, घटक प्रजातियों के बीच स्थानिक रिश्तों, और रोगाणुरोधी हत्या की हद के साथ संगीत कार्यक्रम में 22-24 का विश्लेषण किया जा सकता है। इस तरह की क्षमताओं मानक प्रेषित प्रकाश या epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग संभव नहीं हैं। यह सावधानी से नियंत्रित परिस्थितियों (प्रवाह, तापमान, पीएच, आदि) के तहत biofilms के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है और केवल तरल 25-27 की छोटी मात्रा की आवश्यकता के रूप में आगे, microfluidics सूक्ष्म जीव विज्ञान के क्षेत्र में विशेष ध्यान हुई। उस हासिल रूप में तुलना का एक बिंदु के रूप में, एक समान प्रवाह दर और कतरनी में 20 घंटे के लिए एक प्रवाह सेल मॉडल प्रणाली (यकीनन कई मौखिक biofilm अध्ययन के लिए मुख्य आधार मॉडल माना जाता है कि एक प्रणाली) के भीतर मानव लार में एक मौखिक biofilm बढ़ रहा हैmicrofluidic युक्ति 28-31 में 800 μl के लिए विरोध के रूप में एक microfluidic प्रणाली में, कम से कम 200 मिलीलीटर की आवश्यकता है। इस प्रकार, एक microfluidic मॉडल biofilm प्रणाली परिभाषित शर्तों के तहत मात्रा सीमित सामग्री के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। अंत में, pyrosequencing प्रौद्योगिकी एक समुदाय विश्लेषण करने के लिए सामग्री की ही छोटी मात्रा की आवश्यकता के लिए पिछले एक दशक में अनुकूलित और भी दुर्लभ biofilm प्रजातियों की पहचान प्राप्त करने के लिए अनुक्रमण की गहराई को नियंत्रित करने के लिए पर्याप्त रूप से बहुमुखी है किया गया है। ऐसे जीवाणु टैग इनकोडिंग FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) के रूप में इस तकनीक का उपयोग करते हैं, biofilms के पारिस्थितिकी के विषय में प्रासंगिक प्रश्नों के लिए अनुमति दी गई है 32,33 संबोधित किया जाना है। इस तरह के सवालों pyrosequencing क्योंकि समय और प्लाज्मिड पुस्तकालयों और डेटा 33,34 प्राप्त करने के लिए आवश्यक जटिल तकनीकी और विश्लेषणात्मक चरणों बनाने के लिए आवश्यक लागत के लिए उपलब्ध नहीं था जब अतीत में कठिनाइयों imbued। संस्कृति स्वतंत्र एपी के साथ बेशक, एक महान लाभऐसे pyrosequencing के रूप में proaches, पारंपरिक प्रयोगशाला मीडिया (यानी व्यवहार्य लेकिन गैर कृषि योग्य प्रजाति) के भीतर अलगाव में उगाया नहीं किया जा सकता कि बैक्टीरियल प्रजातियों हो गई है और पहचान मॉडल प्रणाली के भीतर और समुदाय में उनके रिश्तेदार बहुतायत, 36 35 मात्रा निर्धारित किया जा सकता है । के रूप में जल्दी 1963 के रूप में परिप्रेक्ष्य जोड़ने के लिए, देर से सिगमंड Socransky मानव मौखिक मसूड़ों दरार से अलग सामग्री में बैक्टीरिया का लगभग 50% प्रयोगशाला विकास की स्थिति में 37 का उपयोग कर सुसंस्कृत नहीं किया जा सका है कि अनुमान है।
इस तरीके कागज के उद्देश्य के तहत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic (Bioflux) प्रणाली में मौखिक बहु प्रजातियों biofilms विकसित करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए है: (मैं) की स्थिति मानव मौखिक गुहा के प्रतिनिधि और (ii) एक प्रजाति संरचना और बहुतायत के साथ कि supragingival पट्टिका के बराबर है। इसके अलावा, दोनों फ्रीवेयर और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, हम कैसे बुनियादी biofilm पर प्रकाश डालावास्तुकला उपायों biofilm बायोमास, खुरदरापन, और व्यवहार्यता यों के लिए दृष्टिकोण पर ध्यान देने के साथ, CLSM डेटा से प्राप्त किया जा सकता है (लाइव / मृत धुंधला पर आधारित)। अंत में, bTEFAP द्वारा विविधता के विश्लेषण के लिए biofilm सामग्री फसल के लिए आवश्यक कदम वर्णित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तरीके से कागज सेटअप करने के लिए आवश्यक बुनियादी कदम पर प्रकाश डाला गया और जमा मानव लार से ली गई है और फिल्टर निष्फल 25% जमा मानव लार में उगाई मौखिक बहु प्रजातियों biofilms के विकास के लिए अनुमति देने के लिए ए?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों biofilm विकास प्रोटोकॉल और जॉन Battista (Fluxion, सैन फ्रांसिस्को, सीए) Bioflux प्रणाली से संबंधित तकनीकी मुद्दों के विषय में सलाह देने के लिए तैयार करने में मदद के लिए विलियम नैन्स (मिशिगन विश्वविद्यालय) धन्यवाद। शुरू हुआ धन AHR के लिए: (AHR को R21DE018820 एनआईएच) और मिशिगन विश्वविद्यालय यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
| Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| SOFTWARE | ||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | |
| Imaris | Bitplane | |
| Leica SPE | Leica | |
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | |
References
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