Bruk av en High-throughput<em> In Vitro</em> Mikrofluid System for å utvikle muntlige Multi-arter Biofilm

Summary

Målet med denne fremgangsmåter papir er å beskrive bruken av et mikrofluidsystem for utvikling av multi-arter biofilmer som inneholder arter vanligvis identifisert i human supragingival dental plakk. Metoder for å beskrive biofilm arkitektur, biofilm levedyktighet, og en tilnærming til å høste biofilm for kulturavhengig eller kulturuavhengig analyser er uthevet.

Abstract

Det er få høy gjennomstrømming in vitro-systemer som letter utviklingen av flerbestands biofilmer som inneholder mange arter som vanligvis oppdages innenfor in vivo muntlige biofilm. Videre er et system som bruker naturlig menneskelig spytt som næringskilde, i stedet for kunstige medier, særlig ønskelig for å støtte uttrykket av cellulære og biofilmspesifikke egenskaper som etterligner in vivo lokalsamfunn. Vi beskriver en fremgangsmåte for utvikling av multi-art orale biofilmer som er sammenlignbare med hensyn til sammensetning art, å supragingival dental plakk, under betingelser som ligner på den menneskelige munnhulen. Konkret vil dette metoder artikkelen beskriver hvordan en kommersielt tilgjengelig microfluidic system kan tilpasses til rette for utvikling av flerbestands muntlige biofilmer avledet fra og vokst innenfor samlet spytt. Videre kan en beskrivelse av hvordan systemet brukes i forbindelse med en confocal laser scanning mikroskop for å generere 3D-biofilm rekonstruksjoner for arkitektoniske og levedyktighet analyser vil bli presentert. Gitt den brede mangfold av mikroorganismer som vokser innenfor biofilmer i microfluidic system (inkludert Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, og Porphyromonas), vil en protokoll også bli presentert som beskriver hvordan du høste biofilmceller for ytterligere subkultur eller DNA-ekstraksjon og analyse. Grensene til både microfluidic biofilm system og dagens state-of-the-art dataanalyser vil bli behandlet. Til syvende og sist, er det for seg at denne artikkelen vil gi en baseline teknikk som vil forbedre studie av oral biofilm og hjelp i utviklingen av flere teknologier som kan integreres med microfluidic plattform.

Introduction

Biofilmer er arkitektonisk komplekse samfunn av bakterier som aggregeres på overflater ^1. Disse samfunnene typisk inneholde mange arter som samhandler med hverandre innenfor biofilm ^to. Muntlige biofilmer, den mest visuelt iøynefallende være plakk, er et vedvarende problem hos mennesker og deres ukontrollerte utviklingsresultater i generering av taksonomisk diverse flerartssamfunn ^tre. Komponent bakterier av disse ulike samfunnene kan være opptil 1000 ganger mer motstandsdyktig mot antibiotika enn sine frittflytende (planktoniske) kolleger ^4-6. Unnlatelse av å behandle disse muntlige biofilmsamfunn, noe som kan føre til karies og periodontal sykdom, har resultert i en betydelig offentlig helsebelastning: over 500 millioner besøk til tannlegen kontoret per år i USA, og en ca $ 108 000 000 000 for å behandle eller forebygge periodontal sykdom og tannråte ^7.

innhold ">" Mens mange mikrobiologer argumentere studere mikrobiell oppførsel under naturlige forhold, noen av dem gjøre det. Dette er fordi deres moral for å overvinne vanskelighetene er stadig tappet av den attraktive enkel å jobbe med laboratoriekulturer. "-Smith ^8.

I dag, er oral biofilm forskning utført ved hjelp av en rekke in vivo og in vitro tilnærminger, hver med sine egne fordeler og ulemper ^9,10. In vitro nærmer ofte bruker modellbiofilmsystemer som er relativt enkelt å sette opp, men kan mangle klinisk / virkelige verden relevans ^10,11. In vivo tilnærminger vanligvis stole på dyremodellsystemer som kan gjengi visse aspekter ved den menneskelige muntlig miljø, men igjen lider av begrensninger på grunn av forskjeller i anatomi, fysiologi, mikrobiologi og immunologi mellom dyr og mennesker ^{12, 13.} Det bør bemerkes at orale biofilmerkan også utvikles på emaljerte overflater holdt i en stent i munn av frivillige mennesker, men denne tilnærmingen er i dag relativt kostbart og arbeidskrevende ^14,15. Til syvende og sist, er nye midler eller teknologier for å forbedre munnpleie testet på mennesker under kontrollerte kliniske studier forhold ^11. I dag er en ofte brukt modus operandi for å identifisere og evaluere nye orale helsetjenester agenter for å først utføre laboratoriestudier for å skjelne potensiell effekt, og deretter utføre dyreforsøk og "feltforsøk" som ansetter leger for å vurdere effekten av teknologien ^{9, 16,17.} Dessverre, laboratoriestudier har en tendens til å stole på modellsystemer som opptar en stor plass, er teknologisk utfordrende å bruke, og inneholder ofte forenklet samfunn av ett eller høyst noen få arter å utlede potensiell virkelige verden betyr ^10,18. Gitt at dental plakk biofilmer inneholde flere arter og form i en komplex flyter spytt miljøet, utvikle biofilm som inneholder ett eller noen få arter i kunstige medier vil neppe kunne gi lokalsamfunn som oppfører seg på en lignende måte som de i et realistisk scenario ^10,19. For å adressere tid, kostnader, krav til opplæring, og de ​​fattige representant natur laboratorium modellbiofilmsystemer i forhold til den virkelige verden miljø, vi har nylig utviklet en høy gjennomstrømming og miljø germane biofilm system ²⁰ (figur 1). Systemet tilbyr bruk av mobilfrie pooled menneskelig spytt (CFS) som medium og ubehandlet sammenslått humant bakteriecellen holdig spytt (CCS) som inokulum. Unikt, kombinerer systemet også microfluidic teknologi, et konfokal laser scanning mikroskop, og kulturuavhengig bakteriell mangfold analyse-teknologi. Således er modellsystemet miljømessig germane (ved hjelp av spytt som inokulum til å vokse multiarts biofilmer ved 37 ° C i filter-sterilisert strømmerspytt) og den muntlige biofilmer inneholde arter (inkludert Streptococcus, Neisseria, Veillonella og Porphyromonas arter) i hopetall er representative for de som finnes i tidlig supragingival plakett ^20.

Når de vurderer at dette arbeidet beskriver bruk av den nyutviklede modellsystemet, må spesiell oppmerksomhet gis til sammenslåing av et konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) MicroFluidics, og kulturuavhengig mangfold analyseteknologier. Unionen av disse teknologiene ved vår forskningsgruppe var tilsiktet og ikke bare legger en høy gjennomstrømming evne til den nyutviklede modellsystemet, men tillater også spørsmål som skal stilles som ikke kunne være lett adressert før med andre systemer. For det første har CLSM distinkte fordeler i forhold til tradisjonell mikroskopi som gjør det mulig for tredimensjonal analyse av biofilmer. Ofte lite verdsatt, dette er ekstremt viktig som biofilm er heterogene viddh hensyn på artssammensetning og romlig posisjon, så vel som de fysiologiske betingelser som pålegges på forskjellige romlige steder i biofilmen ^6,21. I konsert med tredimensjonal gjengivelse programvare og programvare for bildeanalyse, biofilm arkitektur, romlige relasjoner mellom komponent arter, og omfanget av antimikrobiell drap kan analyseres ^22-24. Slike evner er ikke mulig å bruke standard overført lys eller epifluorescence mikroskopi. Deretter har MicroFluidics fått særlig oppmerksomhet innen mikrobiologi som gjør det mulig å studere biofilmer under nøye kontrollerte betingelser (strømning, temperatur, pH, etc.) og krever bare små volumer av væske ^25-27. Som et utgangspunkt for sammenligning, vokser en oral biofilm i humant spytt i en strømningscelle modell system (et system som uten tvil betraktes som bærebjelken modell for mange orale biofilm studier) i 20 timer ved en tilsvarende strømningshastighet og skjærkraft som det som ble oppnåddi et mikrofluidsystem krever minst 200 ml, i motsetning til 800 ul i mikrofluid enheten ^28-31. Dermed gjør en mikrofluid modell biofilm system studiet av kvantitet begrenset materiale under definerte forhold. Endelig har Pyrosekvensering teknologi blitt optimalisert i det siste tiåret til å kreve bare små mengder av materialet for å utføre en analyse fellesskap og er tilstrekkelig allsidig til å kontrollere dybden av sekvensering for å oppnå identiteten til og med sjeldne biofilm arter. Bruk av denne teknologien, som bakteriell tag-kodet FLX amplicon Pyrosekvensering (bTEFAP), har gjort det mulig for relevante spørsmål om økologi av biofilm tas opp ^32,33. Slike spørsmål yret vanskeligheter i det siste når Pyrosekvensering var ikke tilgjengelig på grunn av tid og kostnader som kreves for å skape plasmid biblioteker og de ​​komplekse teknologiske og analytiske trinnene som kreves for å utlede data ^33,34. Selvfølgelig en stor fordel med kulturuavhengig apgangsmåter, slik som Pyrosekvensering, som er den bakterielle arter som ikke kan dyrkes i isolasjon i konvensjonell laboratoriemedier (dvs. levedyktige, men ikke dyrkbare arter) kan dyrkes og identifisert i modellsystemet og deres relative overflod i fellesskap kvantifisert ^{35, 36} . For å legge perspektiv, så tidlig som i 1963 anslått sen Sigmund Socransky at ca. 50% av bakteriene i materialet isolert fra human oral gingival sprekken ikke kan dyrkes ved hjelp av laboratorievekstbetingelser ^37.

Målet med denne fremgangsmåter papir er å beskrive tilnærming for å utvikle orale multiarts biofilmer i en kommersielt tilgjengelig mikrofluid (Bioflux) system i henhold til: (i) betingelser er representative for den menneskelige munnhulen og (ii) med en art sammensetning og mengde at kan sammenlignes med supragingival plaque. Videre bruker både freeware og kommersiell programvare, merker vi hvordan grunnleggende biofilmarkitektur tiltak kan være avledet fra CLSM data, med fokus på metoder for å kvantifisere biofilm biomasse, råhet, og levedyktighet (basert på Levende / Døde farging). Endelig er de trinnene som kreves for å høste biofilm materiale for mangfold analyse av bTEFAP beskrevet.

Protocol

Spytt samling protokollen beskrevet her ble anmeldt av University of Michigan Institutional Review Board for human person Research. MERK: Med hensyn til institusjonelle anmeldelser for menneske arbeid av denne typen, bør tidligere ordninger og tillatelser være fått fra vertsinstitusjonen. Spesielt avhengig av institusjonen, kan IRB eller etikk godkjenning må søkes og godkjennes før spytt samling fra frivillige kan fortsette. Som et hjelpemiddel til å forberede en søknad, kan en nyttig NIH algoritme / kart…

Representative Results

3D-gjengivelse av Biofilm Representative resultater er vist i figur 3. Et nyttig verktøy i IMARIS programvare er muligheten til å undersøke hver bit av det oppsamlede biofilm stabelen, og for å kombinere dem for å skape tredimensjonale rekonstruksjoner. I tillegg kan kunstige skyggeeffekter tilsettes for å hjelpe visuelt tolke tredimensjonale strukturer. De gjengitte biofilmer kan tiltes i alle retninger med forskjellige forstørrelser å utfo…

Discussion

Dette metoder papiret fremhever de grunnleggende trinnene som kreves for å installere og kjøre en microfluidic system på en måte å gi rom for utvikling av muntlige flerbestands biofilmer avledet fra sammenslått humant spytt og dyrket i filter-sterilisert 25% samlet menneskelig spytt. Tilnærminger for å karakterisere biofilm er gitt, men det bør bli husket at disse beskrives tilnærminger er modifiserbare og flere teknologier som, for eksempel, kan flekker eller etiketter bli innført. Som en sak av et eksempel,…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)