El uso de un gran procesamiento<em> In Vitro</em> Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies
Summary
El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan.
Abstract
No son pocos los de alto rendimiento en sistemas in vitro que faciliten el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen numerosas especies comúnmente detectados dentro en vivo biofilms orales. Además, un sistema que utiliza la saliva humana natural como la fuente de nutrientes, en lugar de medios artificiales, es particularmente deseable con el fin de apoyar la expresión de propiedades celulares y biofilm específica que imitan las comunidades in vivo. Se describe un método para el desarrollo de múltiples especies biofilms orales que son comparables, con respecto a la composición de especies, a la placa dental supragingival, en condiciones similares a la cavidad oral humana. En concreto, este artículo se describen los métodos de cómo un sistema de microfluidos disponible en el mercado puede ser adaptado para facilitar el desarrollo de múltiples especies biofilms orales derivados de y crecido dentro de la saliva agrupado. Además, una descripción de cómo el sistema puede ser utilizado en conjunción con un confocal microscopio de barrido láser para generar 3-D reconstrucciones biofilm para los análisis de arquitectura y de viabilidad que se presentará. Dada la amplia diversidad de microorganismos que crecen dentro de los biofilms en el sistema de microfluidos (incluyendo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, y Porphyromonas), un protocolo se presentará también la descripción de cómo cosechar las células del biofilm para más subcultura o la extracción de ADN y análisis. Se tratarán los límites tanto del sistema de biopelícula de microfluidos y los análisis de datos actualizadas con tecnología de última generación. En última instancia, se prevé que este artículo le proporcionará una técnica de línea de base que va a mejorar el estudio de las biopelículas orales y ayudar en el desarrollo de tecnologías adicionales que se pueden integrar con la plataforma de microfluidos.
Introduction
Los biofilms son comunidades complejas arquitectónicamente de bacterias, que se agrupan en las superficies 1. Estas comunidades típicamente contienen numerosas especies que interactúan entre sí dentro de la biopelícula 2. Biofilms orales, siendo la placa dental más conspicuo visualmente, son un problema persistente en los seres humanos y sus resultados para el desarrollo sin control en la generación de taxonómicamente diversas comunidades de especies múltiples 3. Las bacterias que componen estas comunidades diversas pueden ser de hasta 1.000 veces más resistentes a los antimicrobianos que sus homólogos (planctónicos) que flotan libremente 4-6. El no tratar estas comunidades biofilm orales, que pueden causar caries dental y la enfermedad periodontal, se ha traducido en una importante carga de salud pública: más de 500 millones de visitas a la oficina del dentista por año en los EE.UU., y una de aproximadamente 108 mil millones dólar para tratar o prevenir periodontal la enfermedad y la caries dental 7.
contenido ">" Si bien muchos microbiólogos abogan por estudiar el comportamiento microbiano en condiciones naturales, algunos de ellos lo hacen. Esto se debe a su estado de ánimo para vencer las dificultades que está constantemente minada por la atractiva facilidad de trabajar con cultivos de laboratorio. "-Smith 8.En la actualidad, la investigación biofilm oral se llevó a cabo usando una variedad de in vivo e in vitro enfoques, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 9,10. In vitro se acerca a menudo utilizan sistemas de biopelícula modelo que son relativamente fáciles de configurar, pero pueden carecer de clínica / relevancia en el mundo real 10,11. En vivo enfoques normalmente se basan en sistemas de modelos animales que pueden reproducir ciertos aspectos del entorno oral humana, pero una vez más sufren de limitaciones debido a diferencias en la anatomía, fisiología, microbiología e inmunología entre los animales y los seres humanos 12, 13. Cabe señalar que las biopelículas oralesTambién se pueden desarrollar en la superficie del esmalte, celebrada en un stent dentro de la boca de los voluntarios humanos, pero este enfoque es actualmente relativamente costoso y laborioso 14,15. En última instancia, los agentes o las tecnologías para mejorar la salud bucal nuevos se prueban en humanos en condiciones de ensayos clínicos controlados 11. En la actualidad, un modus operandi de uso frecuente para la identificación y evaluación de nuevos agentes de salud bucal es realizar primero los estudios de laboratorio para discernir la eficacia potencial y, a continuación, realizar estudios en animales y "pruebas de campo" que emplean los médicos para evaluar el éxito de la tecnología 9, 16,17. Desafortunadamente, los estudios de laboratorio tienden a basarse en sistemas modelo que ocupan una gran superficie, son tecnológicamente difícil de usar, y con frecuencia contienen simplifican comunidades de uno o como mucho unas pocas especies para derivar el potencial del mundo real que significa 10,18. Dado que los biofilms de la placa dental contienen múltiples especies y forma en un complex fluye medio salival, el desarrollo de biopelículas que contienen una o unas pocas especies en medios artificial es poco probable que genere comunidades que se comportan de una manera similar a las de un escenario del mundo real 10,19. Para hacer frente al tiempo, costo, los requisitos de formación, y la baja representatividad de los sistemas de biopelícula modelo de laboratorio en comparación con el medio ambiente del mundo real, recientemente hemos desarrollado un alto rendimiento y sistema de biopelícula relacionado con el medio ambiente 20 (Figura 1). El sistema se beneficia del uso de saliva libre de células agrupado humano (CFS) como agrupado saliva que contiene células bacterianas humano medio y sin tratar (CCS) como inóculo. Únicamente, el sistema también combina la tecnología de microfluidos, un microscopio de barrido láser confocal, y la diversidad bacteriana tecnología de análisis independiente del cultivo. Por lo tanto, el sistema modelo es pertinente para el medio ambiente (utilizando saliva como inóculo para crecer biopelículas de especies múltiples a 37 ° C en esterilizada por filtración fluyesaliva) y los biofilms orales contienen especies (incluyendo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, y las especies Porphyromonas) en abundancias representante de las que se encuentran en la placa supragingival principios de los 20.
Al considerar que este trabajo se describe el uso del modelo de sistema de nuevo desarrollo, se debe prestar especial atención a la fusión de un microscopio confocal de barrido láser (CLSM) microfluidos, y tecnologías de análisis de la diversidad cultura independiente. La unión de estas tecnologías por parte de nuestro grupo de investigación fue intencional y no sólo añade una capacidad de alto rendimiento para el modelo de sistema de nuevo desarrollo, sino que también permite a las preguntas que se les pide que no podría ser fácilmente abordado antes con otros sistemas. En primer lugar, CLSM tiene claras ventajas sobre la microscopía tradicional ya que permite el análisis tridimensional de biofilms. A menudo no apreciado, esto es extremadamente importante como biofilms son ingenio heterogéneah respecto a la composición de especies y la posición espacial, así como las condiciones fisiológicas se imponen en diferentes lugares espaciales dentro del biofilm 6,21. En concierto con software tridimensional de renderizado y software de análisis de imagen, la arquitectura biofilm, las relaciones espaciales entre las especies componentes, y el alcance de la matanza antimicrobiana puede ser analizado 22-24. Estas habilidades no son posibles con luz transmitida estándar o microscopía de epifluorescencia. A continuación, la microfluídica ha obtenido una atención especial en el campo de la microbiología, ya que permite el estudio de biofilms en condiciones cuidadosamente controladas (flujo, temperatura, pH, etc.) y sólo requiere pequeños volúmenes de líquido 25-27. Como punto de comparación, el crecimiento de un biofilm oral en la saliva humana dentro de un sistema modelo de celda de flujo (un sistema que se considera posiblemente el modelo de apoyo principal para muchos estudios de biofilm oral) durante 20 horas a una velocidad de flujo similar y de cizallamiento que el logradoen un sistema de microfluidos requiere por lo menos 200 ml, en comparación con 800 l en el dispositivo de microfluidos 28-31. Por lo tanto, un sistema modelo biofilm microfluidos permite el estudio de los materiales cantidad limitada bajo condiciones definidas. Por último, la tecnología de pirosecuenciación se ha optimizado en la última década para requerir sólo pequeñas cantidades de material para llevar a cabo un análisis de la comunidad y es suficientemente versátil para controlar la profundidad de la secuenciación para obtener la identidad de las especies del biofilm incluso raros. El uso de esta tecnología, tales como bacterias etiqueta codificada FLX amplicón pirosecuenciación (bTEFAP), ha permitido preguntas pertinentes sobre la ecología de las biopelículas que se abordarán 32,33. Tales preguntas imbuidos dificultades en el pasado, cuando pirosecuenciación no estaba disponible debido al tiempo y los costes necesarios para crear bibliotecas de plásmidos y las complejas medidas tecnológicas y analíticas necesarias para obtener datos de 33,34. Por supuesto, una gran ventaja con independiente del cultivo apenfoques, tales como la pirosecuenciación, es que las especies bacterianas que no se pueden cultivar en el aislamiento dentro de los medios de laboratorio convencional (es decir, especies viables pero no cultivables) pueden ser cultivadas e identificadas en el sistema de modelo y su abundancia relativa en la comunidad cuantificaron 35, 36 . Para añadir perspectiva, tan pronto como 1963, el difunto Sigmund Socransky estima que aproximadamente el 50% de las bacterias en el material aisladas de la grieta gingival oral humana no podía cultivarse usando las condiciones de crecimiento de laboratorio 37.
El objetivo de este trabajo es describir los métodos de enfoque para desarrollar biofilms de especies múltiples orales en un sistema de microfluidos disponible comercialmente (BioFlux) en: (i) las condiciones representativas de la cavidad oral humana y (ii) con una composición y abundancia de especies que es comparable a la placa supragingival. Además, utilizando tanto software freeware y comercial, destacamos biofilm lo básicomedidas arquitectura se pueden derivar de los datos CLSM, con un enfoque en los enfoques para cuantificar la biomasa biopelícula, la rugosidad y la viabilidad (basadas en la tinción Live / Dead). Por último, se describen los pasos necesarios para cosechar material de biopelícula para el análisis de la diversidad por bTEFAP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento pone de relieve los métodos pasos básicos necesarios para configurar y ejecutar un sistema de microfluidos de manera de permitir el desarrollo de biopelículas de especies múltiples orales derivados de agrupado saliva humana y cultivadas en esterilizada por filtración 25% agrupado saliva humana. Se dan aproximaciones para caracterizar el biofilm, pero cabe recordar que estos enfoques descritos son modificables y tecnologías adicionales como, por ejemplo, manchas o etiquetas se pueden introducir. Como…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a William Nance (Universidad de Michigan) para obtener ayuda en la formulación de los protocolos de crecimiento del biofilm y Juan Battista (Fluxion, San Francisco, CA) para obtener asesoramiento sobre cuestiones tecnológicas relacionadas con el sistema BioFlux. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH: R21DE018820 a AHR) y la Universidad de Michigan fondos iniciales para AHR
Materials
| SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
| Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| SOFTWARE | ||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | |
| Imaris | Bitplane | |
| Leica SPE | Leica | |
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | |
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