Användning av en hög kapacitet<em> In Vitro</em> Mikrofluidumanordning System för att utveckla muntliga Biofilmer Multi-arter

Summary

Målet med detta metoder papper är att beskriva användningen av ett mikroflödessystem för utveckling av multi arter biofilmer som innehåller arter vanligtvis identifierats i human supragingival plack. Metoder för att beskriva biofilm arkitektur, biofilm livskraft och ett förhållningssätt till skörde biofilm för kulturberoende eller kulturoberoende analyser är markerade.

Abstract

Det finns få hög genomströmning in vitro-system som underlättar utvecklingen av flerarts biofilmer som innehåller många arter som vanligen upptäcks inom in vivo orala biofilmer. Vidare är det särskilt önskvärt ett system som använder naturlig mänsklig saliv som näringskälla, istället för artificiell medier, i syfte att stödja uttrycket av cellulära och biofilmspecifika egenskaper som efterliknar in vivo samhällen. Vi beskriver en metod för utveckling av flera arter orala biofilmer som är jämförbara med avseende på artsammansättning, för att supragingival plack, enligt villkor som liknar människans munhålan. Konkret kommer detta metoder artikeln beskriver hur ett kommersiellt tillgängligt mikroflödessystem kan anpassas för att underlätta utvecklingen av flera arter orala biofilmer som härrör från och odlas inom poolade saliv. Dessutom kan en beskrivning av hur systemet ska användas tillsammans med en confocal laserskanning mikroskop för att generera 3D-biofilm rekonstruktioner för arkitektoniska och lönsamhetsanalyser kommer att presenteras. Med tanke på den breda mångfalden av mikroorganismer som växer inom biofilmer i mikroflödessystem (inklusive Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, och Porphyromonas), kommer ett protokoll också att presenteras som beskriver hur man skörda biofilmcellerna för ytterligare subkultur eller DNA-extraktion och analys. Gränserna för både mikroflödes biofilm systemet och de nuvarande state-of-the-art dataanalyser kommer att tas upp. Ytterst är det tänkt att denna artikel kommer att ge en baslinje teknik som kommer att förbättra studiet av orala biofilmer och stöd i utvecklingen av ytterligare tekniker som kan integreras med mikroflödes plattformen.

Introduction

Biofilmer är arkitektoniskt komplexa samhällen av bakterier som är aggregerade på ytor ^1. Dessa samhällen innehåller vanligtvis många arter som interagerar med varandra inom biofilmen ^2. Muntliga biofilmer, den mest visuellt iögonfallande är dental plack, är ett ständigt problem i människor och deras okontrollerade utvecklingsresultat i generering av taxonomiskt olika samhällen ³ flera arter. Komponent bakterier av dessa olika samhällen kan vara upp till 1000 gånger mer resistenta mot antibiotika än deras fritt flytande (plankton) motsvarigheter ^4-6. Underlåtenhet att behandla dessa muntliga biofilm samhällen, vilket kan orsaka karies och tandlossning, har lett till en betydande folkhälsobörda: över 500 miljoner besök hos tandläkaren kontor per år i USA, och en ungefär $ 108.000.000.000 att behandla eller förebygga parodontal sjukdom och karies ^7.

innehåll ">" Medan många mikrobiologer språkar studera mikrobiell beteende under naturliga förhållanden, några av dem göra det. Det beror på att deras moral för att övervinna de svårigheter ständigt tär av attraktiva enkel att arbeta med laboratoriekulturer. "-Smith ^8.

För närvarande är orala biofilmen forskningen med hjälp av olika in vivo och in vitro metoder, missgynnar alla med sina egna fördelar och ^9,10. In vitro närmar ofta använda modellbiofilmsystem som är relativt lätt att ställa upp, men kan sakna klinisk / verkliga relevans ^10,11. In vivo metoder grundar sig oftast på djurmodellsystem som kan återge vissa aspekter av människans orala miljön, men återigen drabbas av begränsningar på grund av skillnader i anatomi, fysiologi, mikrobiologi och immunologi mellan djur och människor ^{12, 13.} Det bör noteras att orala biofilmerkan också utvecklas på emaljytor som hölls i en stent inom munnen på frivilliga försökspersoner, men detta tillvägagångssätt är för närvarande relativt dyrt och arbetskrävande ^14,15. Ytterst är nya medel eller tekniker för att förbättra oral sjukvård testas på människor under kontrollerade kliniska prövningsförhållanden ^11. För närvarande är ett ofta använt arbetssätt för att identifiera och utvärdera nya orala vårdmedel för att först utföra laboratoriestudier att urskilja potentiella effekt, och sedan utföra djurstudier och "fältförsök" som sysselsätter kliniker att utvärdera framgången med tekniken ^{9, 16,17.} Tyvärr, laboratoriestudier tenderar att förlita sig på modellsystem som upptar en stor fotavtryck, är tekniskt utmanande att använda, och ofta innehåller förenklade samhällen av en eller högst ett fåtal arter att härleda potentiella verkliga mening ^10,18. Med tanke på att tand plack biofilmer innehåller flera arter och form i ett komplex flyter spott miljö, utveckla biofilmer som innehåller en eller ett fåtal arter i är osannolikt att generera samhällen som beter sig på ett liknande sätt som de i en verklighetstrogen scenario ^10,19 artificiell medier. För att ta itu med tid, kostnad, utbildningskrav, och den dåliga representativitet av laboratoriemodellbiofilmsystem jämfört med verklighetstrogen miljö, nyligen utvecklat vi en hög genomströmning och miljö german biofilm systemet ²⁰ (Figur 1). Systemet fördelarna med användning av cellfria sammanslagen human saliv (CFS) som medium och obehandlade poolat humant bakteriecell-innehållande saliv (CCS) som ett inokulum. Unikt, systemet kombinerar också mikroflödesteknik, en konfokala laserskanning mikroskop, och kultur oberoende bakteriell mångfald analysteknik. Således är modellsystemet miljö förbunden (med saliv som inokulat att växa biofilmer flera arter vid 37 ° C i filtersteriliserade flytersaliv) och de muntliga biofilmer innehåller arter (inklusive Streptococcus, Neisseria, Veillonella och Porphyromonas arter) i abundances representativa för de som finns i början av supragingival plack ^20.

När man överväger att detta arbete beskriver användningen av det nyutvecklade modellsystem, måste särskild uppmärksamhet ägnas åt sammanslagningen av en konfokala laserskanning mikroskop (CLSM) mikrofluidik och kulturoberoende teknik mångfaldsanalys. Unionen av dessa tekniker genom vår forskargrupp var avsiktlig och inte bara lägger till en hög genomströmning förmåga att nyutvecklade modellsystem, men också tillåter frågor som ska ställas, som inte kunde vara lätt åtgärdas innan med andra system. För det första har CLSM distinkta fördelar gentemot traditionell mikroskopi eftersom det möjliggör för tre-dimensionell analys av biofilmer. Ofta föga uppskattad, detta är oerhört viktigt som biofilmer är heterogena with gäller artsammansättning och rumslig position samt de fysiologiska villkor ställs på olika rumsliga platser inom biofilmen ^6,21. I samförstånd med tredimensionell rendering programvara och bildanalys programvara, biofilmen arkitektur, rumsliga relationer mellan arter komponent, och omfattningen av antimikrobiell dödande kan analyseras ^22-24. Sådana förmågor är inte möjligt att använda standardfallande ljus eller epifluorescensmikroskopi. Därefter har mikrofluidik rönt särskild uppmärksamhet inom mikrobiologi, eftersom det möjliggör studier av biofilmer under noggrant kontrollerade förhållanden (flöde, temperatur, pH, etc.) och kräver endast små volymer av vätska ^25-27. Som en jämförelse kan nämnas att växa en oral biofilm i mänsklig saliv i en flödescell modellsystem (ett system som utan tvekan anses stöttepelaren modell för många orala biofilm studier) under 20 timmar vid en liknande flöde och skjuvning som uppnåttsi ett mikrofluidsystem kräver minst 200 ml, i motsats till 800 ul i mikrofluidanordningen ^28-31. Således möjliggör en mikroflödesmodell biofilm systemet studiet av kvantiteten begränsade materialet under definierade förhållanden. Slutligen har teknologin Pyrosequencing optimerats under det senaste decenniet för att kräva endast små mängder av material att utföra en gemenskap analys och är tillräckligt mångsidig för att styra djup av sekvense att få identiteten på ens sällsynta biofilm arter. Användningen av denna teknik, såsom bakteriell tagg-kodad FLX amplikon Pyrosequencing (bTEFAP), har gjort för relevanta frågor som rör ekologi biofilmer åtgärdas ^32,33. Sådana frågor genomsyras svårigheter i det förflutna när Pyrosequencing inte var tillgängliga på grund av den tid och de kostnader som krävs för att skapa bibliotek plasmid och de komplexa tekniska och analytiska steg som krävs för att härleda uppgifter ^33,34. Naturligtvis en stor fördel med kultur oberoende apvinklar, såsom pyrosekvensering, är att de bakteriearter som inte kan odlas isolerat inom konventionell laboratoriemedier (dvs. livskraftiga men icke odlingsbara arter) kan odlas och identifieras inom modellsystemet och deras utbredning i samhället kvantifieras ^{35, 36} . För att lägga till perspektiv, så tidigt som 1963, beräknade den sena Sigmund Socransky att cirka 50% av bakterierna i material som isolerats från människo orala tandköttsfickan inte kunde odlas med hjälp av laboratorietillväxtbetingelser ^37.

Syftet med denna metoder papper är att beskriva det tillvägagångssätt att utveckla muntliga flerarts biofilmer i en kommersiellt tillgänglig mikroflödes (Bioflux) systemet under: (i) Villkor representativa för den mänskliga munhålan och (ii) med en artsammansättning och förekomst som är jämförbar med supragingival plack. Dessutom använder både freeware och kommersiell programvara, markerar vi hur grundläggande biofilmarkitektur åtgärder kan härledas från CLSM uppgifter, med fokus på metoder för att kvantifiera biofilm biomassa, råhet, och lönsamheten (baserat på Live / Dead färgning). Slutligen de steg som krävs för att skörda biofilms material för mångfald analys av bTEFAP beskrivs.

Protocol

Saliven samling protokoll som beskrivs häri granskades av University of Michigan Institutional Review Board för Försöksperson. OBS: När det gäller institutionella recensioner för mänskliga subjektet arbete av denna typ bör tidigare arrangemang och tillstånd åter samlat från värdinstitutionen. I synnerhet beroende på institutet, IRB eller etik godkännande kan behöva sökas och godkännas innan saliv samling från frivilliga människor kan gå vidare. Som ett stöd för att förbereda en ansökan, k…

Representative Results

3D-rendering av Biofilmer Representativa resultat visas i figur 3. Ett användbart verktyg i Imaris mjukvaran är möjligheten att undersöka varje bit av den insamlade biofilm stacken och kombinera dem för att skapa tredimensionella rekonstruktioner. Dessutom kan konstgjorda skuggeffekter tillsättas för att hjälpa visuellt tolka tre-dimensionella strukturer. De renderade biofilmer kan orienterade i någon riktning med olika förstoringar att ut…

Discussion

Detta metoder papper belyser de grundläggande stegen som krävs för att installera och köra ett mikroflödessystem på ett sätt för att möjliggöra en utveckling av orala flerarts biofilmer som härrör från poolade mänsklig saliv och odlas i filtersteriliserad 25% poolade mänsklig saliv. Metoder för att karakterisera biofilmen ges men man bör komma ihåg att dessa beskrivna metoder är modifierbara och ytterligare tekniker som, till exempel, kan fläckar eller etiketter införas. I själva exempel kan man t?…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)