Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
Tap av dopaminerge nevroner fra substantia nigra pars comp fører til kardinal motoriske symptomer på Parkinsons sykdom (PD), den nest mest utbredte nevrodegenerativ lidelse. Den underliggende årsaken til bortfallet av denne mesencefalisk nevronale befolkningen er ikke kjent. Å studere de biokjemiske mekanismer som er ansvarlige for utvikling og modulerende nevrofysiologiske egenskaper og overlevelse av mesDA nevroner, flere cellekultur og dyremodellsystemer har blitt brukt. Udødeliggjorte cellelinjer, inkludert rotte dopaminerg cellelinje 1RB 3 AN 27 (N27), den humane neuroblastom-cellelinje dopaminerge SH-SY5Y, mus dopaminerge hybridcellelinjen og human MN9D mesencefalisk LUHMES celler har vært benyttet for biokjemiske og begrensede mekanistiske undersøkelser 1 -5. For studiet av den spesifikke tap av mesDA neuroner, flere neurotoxin basert og genetiske modeller er blitt utviklet til 6-8. Primære ventral midthjernen kulturer, Gi et uunnværlig verktøy for å studere de nevronale synaptiske og egenskaper av de dopaminerge neuroner og trasé som er involvert i patogenesen av denne vanlig lidelse.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for isolering av mesencefalisk dopaminerge neuroner, som inneholder modifikasjoner som fører til høyere overlevelsesevne, og øker utbyttet av dekkglass pr embryo. Bruk av pre-moden E12.5 mus mesencephalon (E14.5 i rotte) forbedrer overlevelsesevne. I denne alderen nevroner har ikke utviklet aksoner ennå, noe som etterlater celler intakt under disseksjon og minimerer stress dermed vesentlig øker levedyktighet. I tillegg forsiktig disseksjon av ventral midthjernen, som beskrevet i kapittel 2 i denne protokoll, forbedrer overlevelsesevne ytterligere. Å øke antall Dekk per embryo, er en alternativ plating metode presentert i kapittel 4 i denne protokollen. Dette fører til et utbytte på opp til 10 dekkglass pr embryo i forhold til 4 Dekk henholdvanlige pletteringsforholdene og dermed redusere mengden av dyr per eksperiment.
Nevroner i kultur utstillings utvekst av axoner og dentrites, danner synaptiske forbindelser og avsløre tilstedeværelsen av nevronale og synaptiske markører gjør disse kulturene egnet for levende celle bildebehandling, immunocytokjemisk og elektrofysiologiske studier. Videre, bruk av nevronale kulturer letter genetiske og farmakologiske manipulasjon. Utvekst av neuritter fra dag 2 in vitro åpner for utviklingsstudier. Videre er langtidsoverlevelse av kulturer (opp til seks uker) gjør dem egnet for studium av langsom, progressiv degenerering av disse neuroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopaminerge nevroner i midthjernen er den viktigste kilden til dopamin i sentralnervesystemet. De er delt inn i tre grupper, substantia nigra pars comp (SNpc), ventral tegmentale området (VTA) og retrorubral felt (RRF) 10, 11. Nevroner i SNpc og VTA gi opphav til store dopaminerge trasé, mesocortical, mesolimbiske og Nigro-striatale, involvert i funksjoner som for eksempel kontroll av følelser, motivasjon og motor atferd. Avgangen av nevroner i SNpc og funksjonell forstyrrelse av nigrostriatale systemet er…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
