Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии
Summary
Существует много различных методов для измерения внеклеточной пузырьков (EVS) с помощью проточной цитометрии (FCM). Некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Два протокола для измерения электромобилей представлены, используя либо отдельные обнаружения или подход шарик на основе.
Abstract
Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.
Introduction
Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.
Электромобили, также известный как микрочастиц, небольшие, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, которые участвуют в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов 1. Через экспрессии различных поверхностных маркеров и / или прямой передачи биологического материала, электромобили способны изменить функцию клеток-реципиентов играть либо активации или подавления роль в межклеточной коммуникации 2 – 4. Клинически, тромбоцитарный электромобилей, как известно, имеют сильную антикоагулянтной активностью 5, в то время как другие, как было показано, чтобы способствовать в широком диапазоне условий, от продвижения опухоли metastaSIS 6 к защите от болезней 7. Электромобилей могут быть разделены на более мелкие категории клеток, полученных везикул, такие как экзосом и микропузырьки (MVS), в зависимости от их размера и механизма генерации 8. Номенклатура клеток, полученных субпопуляций пузырьков продолжает оставаться темой продолжающейся дискуссии 8,9, однако, экзосомы как правило, описываются как маленькие, от 40 до 100 нм частицы, полученные из эндосомный слияния с плазматической мембраной, в то время как MVs больше, от 100 до 1000 нм частицы формируется пролития мембраны плазмы 10. Здесь общий термин "электромобилей" будет использоваться для обозначения всех типов внеклеточных биологических везикул, опубликованным клеток.
Выделение электромобилей из цельной крови является многоступенчатой процедуры и многие различные переменные обработки было показано, что повлияет EV содержание, в том числе температуры и продолжительности хранения 11,12, антикоагулянта / консерванта, используемого 13 иМетод центрифугирования используется 14. Необходимость в стандартизации этих переменных привело к рекомендациям Международного общества по изучению тромбозов и обработки крови и выделения EV процедур гемостаза научных и комитет по стандартизации (ISTH SSC) для правильного 15,16, но не существует консенсуса среди исследователей по оптимальной протокола использовать 12. Большинство согласится с тем, однако, что жестким контролем преаналитического переменные имеют решающее значение для точных и воспроизводимых данных.
Для того чтобы проанализировать электромобилей, исследователи использовали различные методы, в том числе просвечивающей электронной микроскопии 17, сканирующей электронной микроскопии 18,19, атомно-силовой микроскопии, динамического рассеяния света 20,21 и Вестерн-блоттинга 22,23. В то время как FCM является методом выбора для многих исследователей 9,24 – 26 из-за его высоких возможностей пропускной способности, анализ электромобилей с использованием ТСМ былкак известно, трудно из-за их размера и отсутствия дискретных положительных населения 27 – 32. По сравнению с анализом клеток, небольшой размер EVs приводит 1) меньше флуоресценции, испускаемой из-за меньшего числа антигенов на частицу, и 2) ограничено осуществимость после промывки пятен, которые необходимо уменьшить фоновой флуоресценции. Общие проблемы среди исследователей относятся сигналы, возникающие в связи с иммуноглобулина агрегатов 27,28 и самоагрегации антител 29. Кроме того, длительное время обработки и длительные процедуры стирки / изоляции, используемый многими из нынешних протоколов 33,34 требуют обязательства времени многодневные анализировать небольшое количество образцов, что делает их менее идеально подходит для применения при высоких пропускную способность. Некоторые исследователи отказаться шаг стирки в целом, оказание традиционно используются ТСМ негативные элементы управления, такие как флуоресценция минус один (FMO) и изотипов антител бесполезной для точной оценки концентрации алкоголя в кровиkground флуоресценции 30.
Наши протоколы решить три общие проблемы, которые могут препятствовать надлежащего анализа ТСМ электромобилей: Сигналы, возникающие на основе агрегатов антител и других не-пузырьков, трудности при удалении несвязанного антитела и отсутствия заметных положительных населения. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональным образом, чтобы минимизировать обнаружение фоновой флуоресценции. Два разных методов обнаружения представлены здесь: Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарики на основе, чтобы захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Были представлены два различных протокола для выделения, обработки и анализа электромобилей, используя какой-либо отдельный обнаружения или бисером подход. Выбор наиболее подходящего метода для использования не всегда проста и требует понимания тестируемому образцу, а также отдельн…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Дейл Hirschkorn от кровеносной систем научно-исследовательского института за помощь в проточной цитометрии настройки прибора. Эта работа была поддержана NIH предоставляет HL095470 и U01 HL072268 и МО контракты W81XWH-10-1-0023 и W81XWH-2-0028.
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation–and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Recherche en cancérologie. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -. M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
