Capitalisant sur une stratégie génétique binaire, nous fournissons un protocole détaillé pour le traçage des circuits neuronaux chez les souris qui expriment des traceurs transsynaptiques complémentaires après recombinaison médiée par Cre. Parce que la production de traceurs spécifiques aux cellules est codée génétiquement, notre approche expérimentale convient pour étudier la formation et la maturation des circuits neuronaux au cours du développement du cerveau embryonnaire murin à une résolution cellulaire unique.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le traçage du chemin anatomique est d’une importance cruciale pour déchiffrer la relation entre le cerveau et le comportement. Cependant, il est techniquement difficile de démêler la formation des circuits neuronaux au cours de la maturation embryonnaire du cerveau, car la plupart des méthodes de traçage transsynaptique développées à ce jour dépendent de l’injection de traceur stéréotaxique. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une stratégie génétique binaire pour le traçage génétique transsynaptique conditionnel dans le cerveau de la souris. À cette fin, nous avons généré deux souches de souris knock-in complémentaires pour exprimer sélectivement le traceur transsynaptique bidirectionnel lectine d’orge (BL) et le fragment C de la toxine tétanique transsynaptique rétrograde à partir du locus ROSA26 après recombinaison médiée par Cre. La production de traceurs spécifiques aux cellules chez ces souris est codée génétiquement et ne dépend pas de l’injection mécanique de traceurs. Par conséquent, notre approche expérimentale est adaptée pour étudier la formation des circuits neuronaux dans le cerveau murin embryonnaire. De plus, étant donné que le transfert de traceurs entre les synapses dépend de l’activité synaptique, ces souches de souris peuvent être utilisées pour analyser la communication entre des populations neuronales génétiquement définies pendant le développement du cerveau à une résolution cellulaire unique. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour le traçage transsynaptique dans les embryons de souris à l’aide des nouveaux allèles recombinants ROSA26. Nous avons utilisé cette technique expérimentale afin de délimiter les circuits neuronaux sous-jacents à la maturation de l’axe reproducteur dans le cerveau de souris femelle en développement.
Introduction
Chemin tracé anatomique est l'un des outils les plus couramment utilisés pour déchiffrer la relation entre le cerveau et le comportement 1. Progrès dans les technologies de circuits neuronaux traçage a accordé neuroscientifiques avec la capacité de retracer les circuits neuronaux de populations de neurones génétiquement identifiés chez la souris deux. En dépit de ces progrès techniques, il reste difficile de démêler la formation des circuits neuronaux en particulier pendant la maturation embryonnaire. Ce est parce que la plupart des méthodes de traçage développées à ce jour sont basées sur l'injection de traceurs transsynaptique stéréota....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
NOTE: Éthique Déclaration: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux de l'Université de Hambourg et l'Université de la Sarre.
1. Préparation et fixation du tissu embryonnaire
- Disposer tout l'équipement nécessaire pour disséquer les embryons et préparer des solutions pour la fixation ultérieure du tissu avant de sacrifier les animaux.
REMARQUE: Toujours préparer une nouvelle paraformaldéhyde 4% (PFA) solution (PFA 4% dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS), ajuster le pH à 7,4). - Euthanasier chronométré souris femelle enceinte avec une procéd....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Cette section montre des résultats représentatifs qui peuvent être obtenus en collaboration avec le R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) et la R26-GTT (G FP TT C) allèles. Ici, nous utilisons la R26-BIZ et les allèles R26-GTT pour analyser la maturation des circuits neuronaux qui régissent l'axe de la reproduction. Reproduction chez les vertébrés est centralisé par un petit sous-ensemble de neurones dans l'hypothalamus, qui sécrètent l'hormone de libérati.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Exprimant traceurs transsynaptique comme transgènes pour tracer les circuits neuronaux de populations neuronales génétiquement définies présente plusieurs avantages par rapport à l'injection stéréotaxique de traceurs ou des virus neurotopic. Tout d'abord, le traceur est produit comme une protéine endogène et donc ne provoque pas de réponse immunitaire et une voie neuronale sélective peut être analysé en différents animaux avec une reproductibilité élevée. Deuxièmement, parce que ce est un procédé non invasif, il.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Remerciements
Nous remercions Michael Candlish pour ses commentaires critiques sur le manuscrit. Ce projet a été soutenu par les subventions BO1743/6 et SFB/TRR 152 P11 et Z02 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à Ulrich Boehm.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bisbenzimide (colorant Hoechst 33258) | Sigma | 14530-100MG | |
| Éthanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo moule (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Diméthylformamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldéhyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Peroxyde d’hydrogène | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Méthyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Gélatine glycine Kaiser’s | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitut | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Désoxycholate de sodium | Sigma | D6750-25G | |
| Saccharose | Sigma | S7903-1KG | |
| Glissières Superfrost | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| kit TSA | PerkinElmer | NEL700 | |
| Kit TSA plus | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| DIC | Zeiss | Axioskop2 équipé du logiciel | |
| Microscope fluroscence | Zeiss | Axioskop2 équipé du logiciel | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Chèvre anti-WGA (reconnaît BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Cheval biotinylayé anti-chèvre | IgG Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Chèvre biotinylée anti-lapin IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Lapin anti-GFP (reconnaît GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Lapin anti-GnRH | Affinity Bio Réactif | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-lapin IgG Thermo | Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Amorces | |||
| BL Fwd (pour le génotypage BIZ) | Eurofins MWG Operon | ATGAGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (pour le génotypage BIZ) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (pour le génotypage Cre) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGAGGTGTTCG | |
| Cre Rev (pour le génotypage Cre) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (pour le génotypage GTT) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (pour le génotypage GTT) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (pour le génotypage par sexe) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (pour le génotypage du sexe) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC |
Références
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in t....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
