Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית
Summary
keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.
Abstract
בשל המאפיינים הייחודיים שלהם ניע, keratocytes הדגים ניתק מתרבויות explant כבר מזמן משמשות כדי לחקור את המנגנונים של נדידת תאים בודדת. עם זאת, כאשר explants הוקם, תאים אלה גם לנוע באופן קולקטיבי, שמירה רב של התכונות ההופכות את פרט keratocytes מודל אטרקטיבי ללמוד הגירה: שיעורים מהירים של תנועתיות, lamellae אקטין עשיר נרחב עם כבל אקטין בניצב, ומהירות קבועה יחסית ו כיוון ההגירה. בexplants המוקדם, הדדי המהירה של תאים נודדים באופן אישי עם אלה נודדים באופן קולקטיבי מאפשר הלימוד של התפקיד של הידבקויות תאי תאים בקביעת המצב של הגירה, ומדגיש את הקישורים המולקולריים בין שני המצבים של הגירה. תאים בexplants מאוחר יותר לאבד את היכולת שלהם לנוע במהירות ובאופן קולקטיבי כאפיתל מעבר mesenchymal מתרחש וגנים הקשורים לריפוי פצעים ודלקת באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. לפיכך, explants keratocyte יכול לשמש כמודל במבחנה לreepithelialization המתרחש במהלך ריפוי פצע עורי ויכול לייצג את מערכת ייחודית ללמוד מנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של תכנית מוגדרת של שינויי ביטוי גנים. מגוון רחב של קווי דג הזברה מוטציה ומהונדסים זמין, המאפשר explants שיוקם מדגים עם רקע גנטי שונה. זה מאפשר את התפקיד של חלבונים שונים בתוך תהליכים אלה יש לטפל באופן ייחודי. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתארים שיטה קלה ויעילה להקמת תרבויות explant אלה לשימוש במגוון רחב של מבחני הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית.
Introduction
מחקרים של תנועתיות תא התמקדו בעיקר בתאים בנפרד נודדים. Keratocytes תרבית מדגים ודו-חי explants הוכיח להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של תנועתיות תא באמצעות מודלים מתמטיים והן ניסיוניים גישות 1-6. עבודה ניסויית בתאים בנפרד נודדים נעזר בתנועה המהירה, חלקת הגלישה של התאים, תוך שמירה על צורה, מהירות, וכיוון אחיד. עם זאת, in vivo, תאים לעתים קרובות לעבור באופן קולקטיבי, תוך שמירה על צמתים תא-תא, במיוחד בעובר, ריפוי פצעים, וגרורות. לפיכך, נדידת תאים קולקטיבית הוא אזור גידול והבולט יותר ויותר של מחקר בתחום של נדידת תאים. לאחרונה ההגירה הקולקטיבית של תאים אלה תוארה 7 ויש לו תכונות ייחודיות רבות ההופכות אותו למערכת רבת עוצמה כדי לחקור נדידת תאים קולקטיבית במודל ריפוי פצע.
"> כאשר מאזניים קטפו מדג זברה מבוגרת בהרדמה, כמה רקמות אפיתל נשארה מחוברת לחלק התחתון של הסולם. כאשר מדיום תרבית תאים הוא הוסיף, תאי האפיתל אלה, או keratocytes ove_content, להעביר במהירות כיחידה קולקטיבית מהסולם. ניתן לצפות בתרבות explant כמודל ריפוי פצע אפיתל, שבו התאים לנדוד הרחק מexplant כפי שהם היו על פני המטריצה הזמנית של פצע המיטה כדי לבסס מחדש את האפיתל ללא פגע. נתונים אחרונים מצביעים על כך שvivo לשעבר זה מחקה תרבות תכונות רבות של in vivo ריפוי הפצע בדג זברה מבוגרת. שיעורי סגירת פצעים 8 לתרגם למהירות הגירה דומה לזה שנצפה במערכת vivo לשעבר 7. בנוסף, בפצע in vivo ריפוי מודל, הטיפול בקומדין מצביע על כך שיש עצירה דימום אין כל השפעה על שיעור של ריפוי, בעוד שהטיפול בהידרוקורטיזון כדי להקטין את התגובה חיסונית לא לעכב reepithelialization 8 </sup>. כדג הזברה אינה לדמם כאשר קנה המידה היא להסיר את בעלי החיים, עצירת דימום הוא לא שחקן מרכזי. למרות שמצאנו תאים חיסוניים בexplants, יש לנו לא בחנו את ההשפעות שאולי יש להם בנדידת תאים קולקטיבית.הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להקים תרבויות explant keratocyte דג הזברה שלהבטיח עקביות ושחזור לשימוש במבחנים רבים ביולוגיים. תרבויות explant אלה הן משכנעים במיוחד במודל חוץ גופית לנדידת תאים קולקטיבית מכמה סיבות. ראשית, keratocytes דג הזברה הם תאים ראשוניים בשימוש בתוך שעות של הקמת תרבויות explant. לכן, תאים אלה לא עברו שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים הקשורים למעבר של תאים ראשוניים 9-13. שנית, מערכת זו מהווה מודל לחקר reepithelialization בתגובה לפציעתם 14 ו, כחלק מהתגובה לפציעה, אפיתל לtr mesenchymalansition תהליך (EMT) הוא יזם כפי שמעיד שינויים בביטוי הגנים וארגון מחדש cytoskeletal 14,15. לפיכך, השינויים בביטוי הגנים הרקע ותנועתיות המתרחשים בתאים שלא טופלו כבר מאופיינים ולספק הקשר לפרש שינויים בטיפול. יתר על כן, keratocyte הדגים וkeratinocyte האנושית הן תפקודיות שווי ערך; שניהם תאי האפיתל העיקריים של מיניהם ולשחק תפקיד מפתח בריפוי פצע אפיתל. דג הזברה שלישית, מבוגר זוכה להכרה כמערכת מודל עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם 16-18 כוללים מלנומה וסוגי סרטן אחרים 19-21, פצע cutaneous ריפוי 8,14 ורקמות התחדשות 22-24.
יתרונות טכניים של מערכת מודל זה הם פחות משכנעים. מספר הולך וגדל של קווים מוטנטים ומהונדסים זמינים ללא כוונת רווח, מתקנים מרכזיים. באופן ספציפי, דג הזברה מוטצית הפרויקט (ZMP) בWellcome Trust סנגר המכון שואף ליצור אלל נוקאאוט בכל חלבון קידוד גנטי בגנום דג הזברה. נכון לעכשיו, יש להם מוטציה 11,892 גנים, כ -45% מהגנום, עם 24088 אללים מאופיינים. בנוסף, ZMP מקבל הצעות ויפיק לדפוק outs ללא תשלום. השיטות האחרונות במציאת גן בדג זברה זחל והמבוגר 25-28 לספק גמישות ללמוד את הפונקציה של גנים חשובים מבחינה התפתחותית שלגישות מהונדסים הן בעייתיות או לא מעשיות.
בשלהם שיעורים מאוד מהירים של תנועתיות ~ 145 מיקרומטר / hr זמן קצר לאחר הקמתה של תרבויות 29, ניתן להשלים במהירות מבחני (בדרך כלל 24 שעות באו פחות). כפי שניתן הושלמו ניסויים במהירות ובתרבויות לגדול גם ב RT, כמה מהמכשולים הטכניים הקשורים למבחני נדידת תאי יונקים מעורבים מיקרוסקופיה וידאו נמנעים. בנוסף, בגיל של הידוק תקציבי מחקר, zebrafish נשמרים בקלות ובזול.
המבנה וההתנהגות של explant הוא מורכב. כדגים לא לדמם כאשר קנה המידה מוסר, אין זה סביר כי הרבה יותר משכבות אפידרמיס השטחיות יוסרו עם הסולם. Keratocytes נראה סוג התא הדומיננטי בexplant כאשר קשקשים לראשונה הוסרו מהדגים כמו הרוב המכריע של תאים מופיעים להכתים עם נוגדן אנטי E-cadherin 14. יתר על כן, אין ראיות של fibroblasts בתרבות הראשונית כמו להישפט על ידי העדר כתמי vimentin על ידי immunofluorescence 14. עם זאת, עם הסרת קנה מידה חוזרת ונשנית, נראה שיש מספר רב של נויטרופילים בexplant (ראה וידאו 1). אנו זיהינו תאים אלה כנויטרופילים המבוססים על תצפיות מורפולוגיים לגודל שלהם, במהירות תנועתיות, והגירתם אל מחוץ לגיליון התא בעת החשיפה לLPS (מידע לא מוצג). בנוסף, תאים אלה כתם בהיר שנינותh נוגדנים לגורם cytosolic נויטרופילים, כמו גם עם מגוון רחב של נוגדני IgG משניים, אשר מציין כי יש להם בשפע FcRs על פני השטח שלהם (מידע לא מוצגים). שכבות תאים מרובות נמצאות בתוך explant. מיקרוסקופיה Confocal חושפת את הנוכחות של שכבה אחת ליד הקצה המוביל ליותר משתי שכבות של keratocytes ליד קנה המידה עם נויטרופילים נראים מעל, מתחת, ובין סדיני keratocyte התא.
בנקודות זמן מוקדמות, תאים בקצה לקטב explant הרב שכבתי, ייזום הגירה קולקטיבית של keratocytes מexplant בשיעורים ראשוניים של ~ 145 מיקרומטר / hr. האזור המכוסה על ידי explant מגדיל במהירות, מה שמוביל לתא התפשטות, מתח בתוך גיליון, ושיעור ירידה במראש של הקצה קדמי. interconversions המהיר בין תאי מנהיג וחסיד הם נצפו בקצה המוביל במהלך ההיווצרות וסגירת חורים שנוצרו באופן ספונטני בתוך גיליון 7. כתהליך EMT יזם עם explant ממשיך, הברים וכו 'וkeratocytes לאבד תנועתיות מיוחדת, המהירה. ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם EMT, ריפוי פצעים, ותגובות דלקתיות להתרחש תוך 7 ימים של תרבות עם explants נשקלים קיימא עבור כ 10 ימים 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי ביותר להצלחה של תרבות explant keratocyte מאפשר קנה המידה לדבוק בתרבות הצלחת כ 2-3 דקות לפני תוספת של מדיום התרבות. כ -75% מקשקשים ידבק ולגדול גיליונות (מספר התרבויות שנקבעו לגבי כל ניסוי צריך להיות מותאם בהתאם). גיליונות Keratocyte לא יוצרים סביב כל קנה מידה הוסרה מהדגים ו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמערב התיכונה אוניברסיטת קולג 'למדעי בריאות מחקר הנחיית גרנט זכה לEEH ומשרד אוניברסיטת המערב התיכון של מחקר ותוכניות ממומנים ביצוע העצמי גרנט זכה לKJL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture – primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
