We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.
The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer’s attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.
Den immunologiska synaps (IS) ligger i ett kritiskt skede för cellaktivering och funktion 1. Det är den primära medium genom vilket antigenpresentation och cellmedierad immunitet utförs. De tidigaste mikroskopiska studier av synaps bildning utnyttjade en cell-cell-konjugat systemet 2. Den huvudsakliga begränsningen med detta tillvägagångssätt är att de flesta av konjugaten kommer att ses "i profil", så att säga, vilket begränsar betraktarens uppfattning av den synaptiska strukturen själv. År 1999 Dustin laboratoriet upp denna begränsning genom att utnyttja den glas stöds lipidbiskiktet (SLB) teknik 3, som hade banat tidigare av McConnel laboratoriet 4,5. Detta tillvägagångssätt skaffas antigenpresenterande celler (APC) till förmån för en glas stöds plana lipid yta, i vilken proteiner kan fästas och röra sig fritt i två dimensioner. Med denna metod, Dustin och kollegor kunde to peer direkt upp i tHan Synapse använder hög upplösning fluorescensmikroskopi, och för första gången får en "face-to-face" titta på strukturen i IS.
Med hjälp av SLB-systemet, har detalj med vilken IS kan visualiseras begränsats endast av begränsningarna hos nuvarande avbildningstekniker 6-8. Använda standardbelysningstekniker, den lägsta upplösningen (dvs minsta avstånd mellan två skilda objekt där de kan urskiljas) har varit <200 nm utifrån Rayleigh kriterium 9. Denna gräns hindrar avbildning av mycket fina, molekylnivå strukturer som utgör synapsen, och fram till utvecklingen av super-upplösningsavbildningstekniker 10-12, var visualisering av dessa strukturer begränsas till avbildning av fixerade celler med användning av elektronmikroskopi.
Med den senaste tidens tillkomsten av en rad superupplösningsteknik, såsom SIM (strukturerad belysning mikroskopi), Palm (photoactivated lokalisering mikroskopi), STORM (stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi), och STED 10-12, utredare har nu möjlighet att studera dessa synaptiska strukturer i oöverträffad detaljrikedom, vilket i sin tur gav en alltmer klar förståelse av IS. Fördelarna med STED mikroskopi har beskrivits före 13. Här beskriver vi superupplösning avbildning med STED mikroskopi utrustad med nyutvecklade 660 nm utarmning laser. Jämfört med konventionella 592 nm utarmning laser tillåter 660 nm laser för en bredare urval av fluorescerande färgämnen (se http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), särskilt dessa röda fluoroforer.
Andra publikationer har beskrivit STED avbildning av NK-cell synapser på antikroppsbelagda glasskivor 13,14. Här, är SLB-systemet i kombination med superupplösning STED mikroskopi för att studera NK-cell synapsen. Denna teknik har fördelen framför antikropps-belagda objektglasen för att vara ett fluidum mosaik, i vilken de inbäddade ytproteiner kan röra sig fritt i ett platt tvådimensionell yta (xy-planet). Detta härmar mer troget den organiska och mobila ytan av en målcell, och följaktligen bättre rekapitulerar bildandet av en fysiologiskt relevant immun synapsen.
Målet med detta protokoll är att ge slutanvändaren med en detaljerad beskrivning av hur man bilden den immunologiska synapsen av NK-celler genom att kombinera SLB-systemet och super-upplösning STED mikroskopi. Det kommer att ge slutanvändaren med nödvändiga åtgärder för att: bereda liposomerna, konstruera protein inbäddade bilayers, bestämma proteintäthet på lipidbiskikten, och förvärva super upplösning använder STED mikroskopi. Dessa tekniker är inte begränsade till området för immunologi, och kan grovt utnyttjas inom en mängd olika discipliner.
Det nya med den aktuella studien är att den kombinerar SLB-tekniken med STED att studera NK cell synapser. Tidigare studier har avbildat lipiddubbelskiktet med TIRF för att studera T-cell synaps bildning 8 och signalmolekyl handel på plasmamembranet 6. Andra har beskrivit STED avbildning av NK-cell synapser använder antikroppsbelagda glasskivor 13,14. Hybrid metod som beskrivs häri ytterligare bygger på dessa insatser genom att avbilda NK cellen synaps med ökad tydlighet ges genom superupplösning som avbildar på lipidbiskiktet ytan, vilket bättre modeller för dynamiska ytan av en APC.
Även SLBs är artificiella membraner saknar av cytoskelettet, lipidaggregat och andra ligander som faktiska målceller eller APC besitter, kan denna teknik rekapitulera viktiga funktioner som rörlighet och orientering av ligander. Detta tillåter SLB systemet att fungera som ett reduktionistiskt tillvägagångssätt dissekera tHan bidrag enskilda receptorer och ligander till bildandet av IS och dynamik IS. Den viktigaste funktionen i SLBs är att forskarna kan kombinera denna teknik med hög upplösning avbildning, såsom konfokal och TIRF mikroskopi. Införandet av STED mikroskopi ökar ytterligare denna fördel, ger oanade insikter i IS forskning och dess kliniska tillämpningar.
En potentiell kritik av detta system är att det SLB inte i tillräcklig utsträckning efterlikna den komplexa ytan av en APC, vilket ger upphov till potentiellt icke-fysiologiska anatomiska drag i de resulterande synapser. Även om det är sant att den begränsade repertoar av ytmolekyler på SLB inte helt rekapitulera den heterogent befolkade ytan av en APC, kan denna gräns också vara fördelaktigt eftersom det tillåter utredarna att fastställa påverkan av enskilda receptor och ligand interaktioner på synaps bildning .
THär finns flera avgörande steg i processen. Bland de mest kritiska är att oxidation av liposomerna förebyggas genom ständigt med argon för att förskjuta syre i röret och lösningen, såsom i steg 1,10, 2,6, och 2,11. Oxidation av lipider kommer att resultera i minskad fett rörlighet, vilket hindrar möjligheten för ytproteiner att röra sig fritt och delta i synaptiska strukturering. Likaså är det också mycket viktigt att avlägsna all kloroform i liposomen genom lyofilisering (steg 1.2). Vid bestämning av proteindensiteten i lipiddubbelskiktet, är det av vikt att först dispergera kiselpärlor i en homogen suspension fri från kluster. Om så är nödvändigt, kan sonikering av pärlor appliceras. I monterings SLB, de tidiga stegen (5,1-5,8), där täck städas, dropparna är placerade, och täck är fäst är avgörande. Ett misstag i någon av dessa kan kräva att starta experimentet över (från början av avsnitt 5). Av denna anledning är detgod praxis att rengöra fler täck än kommer att behövas för att spara tid vid ett missöde.
Icke-klustring är den vanligaste frågan när man arbetar med det här systemet. Om, när visualisera cellerna i det slutliga steget, inte en att hitta några fluorescerande synapser, finns det några steg som kan vidtas. En annan fläck för det besläktade cellytreceptor kan tillsättas till kammaren för att kontrollera att cellen inte har bildat en synaps med dubbelskiktet, medan celler kan vidhäfta ospecifikt till glastäckglas eller biskikt yta, synaptiskt-inblandade ytproteiner bör visas som distinkta kluster vid planet för den cell tvåskikts-gränssnittet, medan unengaged ytproteiner bör visas som diffus färgning runt omkretsen av cellen. Om denna metod misslyckas, bör en kontrollera deras celler via flödescytometri för att säkerställa att den speciella markören en hoppas att studera uttrycks i tillräcklig överflöd på cellytan. Vissa yta proteins är kända för att vara nedregleras över lång sikt in vivo kultur.
Medan detta protokoll detaljer speciellt hur man visualisera NK cell synaps bildning, kan SLB-systemet användas för att studera synaps bildning i någon immunocyt tänkbara enkelt genom substitution av den primära liganden i steg 5.11. Flera ligander kan också tillsättas samtidigt. Man behöver heller inte använda en streptavidin-biotin systemet för vidhäftning av ytproteiner inom biskiktet. Nickel-NTA: histidin interaktioner är också lönsamt. Emellertid, på grund av den höga hållfastheten och specificiteten av streptavidin: biotin interaktion, föredrar vårt labb detta system. Man kan också variera koncentrationen av celler tillsatta på dubbelskiktet från den föreskrivna tätheten i steg 5.13, samt längden på den efterföljande inkubationstiden för att observera synapser i olika skeden av mognad. Detta kan även göras levande, även om detta naturligtvis utesluter möjligheten att visualisera intracellulär structures (såvida de inte redan har märkts med en smält fluorescerande tag; vårt labb använder några sådana förändrade cellinjer). På grund av den höga graden av anpassning möjlig i detta protokoll, kan man använda den grundläggande SLB-tekniken, tillsammans med STED avbildning, för att ta itu med ett otroligt varierat utbud av frågor i immunologi, cellbiologi och biokemi, inklusive grundläggande lipid dynamik 15, synaps bildning 16, intracellulär signalering 17, och tumörcellmetastas 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Purpose |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
25×75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |