Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l'homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Résumé

L’édition de gènes médiée par TALEN au locus AAVS1 permet l’ajout de transgènes à haute efficacité dans les iPSC humaines. Ce protocole décrit les procédures de préparation des CSPi pour l’administration de TALEN et du vecteur donneur, la transfection des CSPi, ainsi que la sélection et l’isolement des clones de CSPi afin de réaliser l’intégration ciblée d’un gène GFP pour générer des lignées rapporteures.

Résumé

L’ajout ciblé de transgènes peut fournir une expression génique persistante tout en contournant le silençage génique et la mutagenèse insertionnelle causée par l’intégration aléatoire médiée par un vecteur viral. Ce protocole décrit une plate-forme universelle et efficace d’addition ciblée de transgènes dans les iPSC humaines, basée sur l’utilisation de TALEN open source validés et d’un donneur de type piège à gènes pour délivrer les transgènes dans un locus de sphère de sécurité. Il est important de noter qu’une édition génomique efficace est limitée par l’efficacité de la distribution des vecteurs d’édition génomique. Par conséquent, ce protocole se concentre d’abord sur la préparation des iPSC pour la transfection afin d’atteindre une efficacité de livraison nucléaire élevée. Lorsque les iPSC sont dissociées en cellules uniques à l’aide d’un réactif de dissociation cellulaire douce et transfectées à l’aide d’un programme optimisé, >50 % des cellules peuvent être induites à absorber les grands vecteurs d’édition de gènes. Étant donné que le locus AAVS1 est situé dans l’intron d’un gène actif (PPP1R12C), un gène de résistance à la puromycine (PAC) lié à l’accepteur d’épissage (SA) a été utilisé pour sélectionner des iPSC ciblées tout en excluant les cellules aléatoires d’intégration uniquement et les cellules non transfectées. Cette stratégie augmente considérablement les chances d’obtenir des clones ciblés et peut également être utilisée dans d’autres expériences de ciblage génique actif. Deux semaines après la sélection de la puromycine à la dose ajustée pour la lignée iPSC spécifique, les clones sont prêts à être prélevés par dissection manuelle de grandes colonies isolées en petits morceaux qui sont transférés dans un milieu frais dans un puits plus petit pour une expansion plus poussée et un dépistage génétique et fonctionnel. On peut suivre ce protocole pour obtenir facilement plusieurs lignées d’iPSC rapporteures de GFP qui sont utiles pour l’imagerie in vivo et in vitro et l’isolement cellulaire.

Introduction

La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes souches embryonnaires cellulaires comme induites (CSPi) a été découvert par Takahashi et al. En 2007 ^1. Fibroblastes dermiques humaines transduites avec rétrovirus exprimant quatre facteurs de transcription (Le Yamanaka soi-surnommé facteurs Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, et Klf4) ont été montrés être très similaire à des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) en fonction de la morphologie, la prolifération, l'expression du gène, et l'état épigénétique; surtout, iPSCs sont également capables de se différencier en cellules des trois couches ger....

Protocole

1. Préparation de la membrane basale Matrix et Revêtement de Plasticware

1. Placez le congelé membrane basale matrice stocks de -20 ° C sur de la glace et décongeler une nuit à 4 ° C.
2. Après décongélation, la pipette des parties aliquotes de 2 mg matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-réfrigérés. Stocker ces à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Pour préparer des plaques de matrice revêtu la membrane basale, dégeler une aliquote sur la glace jusqu'à ce que le dernier morceau de glace dans les disparaît tube Eppendorf (généralement dans ~ 2 h).
4. Après décongélation, ajouter matrice de membrane basale de 12 ml....

Résultats

Une visualisation du protocole est fourni à la figure 2, avec des périodes au cours de laquelle CSPi sont cultivées dans un milieu différent, mis en évidence par soit vert pour E8 ou bleu pour NutriStem. Il est important pour la transfection seulement CSPi de haute qualité; examiner les boîtes de culture tout au long de l'entretien de routine et de vérifier que les cultures iPSC contiennent des colonies distinctes portant principalement une morphologie pavée comme (figure 3A); les c.......

Discussion

Les étapes les plus critiques pour la génération réussie de AAVS1 Coffre-port ciblées CSPi humaines sont: (1) délivrant efficacement Talen et donateurs plasmides dans CSPi par transfection; (2) optimiser la dissociation des CSPi dans des cellules individuelles avant la transfection et le placage densité après transfection; (3) l'optimisation dose et l'heure de la drogue sélection basée sur la croissance de la ligne iPSC; (4) disséquant soigneusement et choisir colonies ciblées et le transfert à la nouvelle plaqu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrigel à facteur de croissance réduit (GFR) Matrice de membrane basale, *sans LDEV, 10 ml	Corning	354230	Stocker à -20 ° ;C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Stocker à 4 ° ;C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Well Plaques	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Stockez le milieu basal à 4 ° ;C. Stockez le supplément à -20 ° ;C.
Y-27632 dichlorhydrate	Tocris	1254	Conserver à température ambiante. Une fois dissous dans H2O, stockez-le à -20 ° ;C.
Chlorure	de sodium Sigma	S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Life Technologies	15575-020
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Life Technologies	14190-250
100 mm Boîte de culture traitée TC	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Stocker dans de l’azote liquide.
DMEM, hyperglycémie, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Stocker à 4 ° ;C.
Sérum fœtal bovin défini, origine américaine	HyClone	SH30070.03	Se conserve à -20 ° ;C. Décongélation à 4 ° ; C pendant la nuit et aliquote. Stocker les aliquotes à -20 ° ; C jusqu’à ce que nécessaire.
Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100X)	Life Technologies	11140-050	Stocker à 4 ° ;C.
Unité 4D-Nucleofector Core  ;	Lonza	AAF-1001B	fait partie du système d’électroporation
4D-Nucleofector X unité  ;	Lonza	AAF-1001X	fait partie du système d’électroporation
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	À votre arrivée, retirez la solution de cellule primaire et complétez-la et rangez-la à 4 ° ;C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Se conserver à -20 °C et décongeler pendant la nuit à 4 °C C et réchauffer une aliquote dans un 37 ° ; C bain-marie avant utilisation.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Conserver à -20 °C et décongeler pendant la nuit à 4 °C C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 et 52638
[en-tête]
AAVS1-CAG-EGFP Donneur de recombinaison homologue	Addgene	22212
Dichlorhydrate de puromycine	Technologies	A11138-03	Stocker à -20 ° ;C. Préparer des aliquotes de travail de 1 mg/ml dans ddH2O.
Pipettes Pasteur jetables en verre borosilicaté	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (réfrigéré), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × ; 750 ml Rotor à godet oscillant	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4 %	Life Technologies	15250-061

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