आंतों का तंत्रिका तंत्र की स्वस्थानी सीए 2 + इमेजिंग में

Summary

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca²⁺ imaging.

Abstract

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca²⁺) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca²⁺ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca²⁺ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca²⁺ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca²⁺ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca²⁺ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca²⁺ responses in enteric neurons and glial cells.

Introduction

आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता) पाचन तंत्र ^एक की दीवार के भीतर एम्बेडेड दो ganglionated चक्रों में आयोजित किया जाता है। ये इंट्रामस्क्युलर तंत्रिका सर्किट, myenteric जाल (मध्य प्रदेश) और submucosal जाल (एसएमपी), न्यूरॉन्स और आंतों का glia (चित्रा 1) ^दो से बना रहे हैं। सांसद और एसएमपी ऐसे आंतों गतिशीलता और उपकला अवशोषण और स्राव, क्रमशः ³ के रूप में जठरांत्र (सैनिक) कार्यों को विनियमित। आंत्र glia गैन्ग्लिया के भीतर न्यूरॉन्स लेकिन आंतों का glia की आबादी के करीब निकटता में स्थित हैं भी फाइबर इलाकों और पेट की दीवार ^3,4 के अतिरिक्त ganglionic अंश परस्पर भीतर मौजूद हैं। आंत्र glia मूल न्यूरॉन्स के लिए केवल पोषक समर्थन प्रदान करने के लिए माना गया। हालांकि, हाल के अध्ययनों से दृढ़ता से सत्ता ^5,6 कार्यों के लिए न्यूरॉन glia बातचीत कर रहे हैं आवश्यक सुझाव देते हैं। उदाहरण के लिए, डेटा आंतों का glia neuronal गतिविधि ^{से 7} "सुनो" बताते हैं किऔर, neuronal सर्किट ^6,8 मिलाना oxidative तनाव ⁹ से आंतों का न्यूरॉन्स की रक्षा और चोट ^10,11 के जवाब में नए आंतों का न्यूरॉन्स पैदा करने में सक्षम हैं। इस तकनीकी समीक्षा में प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीटू इंट्रासेल्युलर सीए ^{2 +} इमेजिंग में उपयोग कर न्यूरॉन्स और आंतों का glia के बीच जटिल परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए एक सरल और मजबूत तरीका प्रदान करता है।

सीए ^{2 +} उत्तेजनीय कोशिकाओं में एक सर्वव्यापी संकेत अणु है और तंत्रिका तंत्र ^{के 12} में synaptic संकेतन घटनाओं में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। न्यूरॉन्स या आंतों का glia की उत्तेजना या तो बाढ़ से सीए ^{2 +} -permeable चैनल या सीए के माध्यम से intracellular कैल्शियम दुकानों से ^{2 +} रिहाई साइटोप्लास्मिक सीए ^{2 +} एकाग्रता में ऊंचाई elicits। Ca इमेजिंग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ न्यूरॉन्स और glia में ^{2 +} यात्रियों एक स्थापित और कार्यात्मक संगठन और की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक हैसत्ता ^13-17। सीए ^{2 +} इमेजिंग आईसीसी पेसमेकर नेटवर्क ¹⁸ और पेट चिकनी पेशी ^19,20 के माध्यम से excitability के प्रसार को स्पष्ट करने के लिए बरकरार सैनिक ऊतक खंडों का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण होना दिखाया गया है। यह शारीरिक मापदंड की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की जांच के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं और उनके स्थानिक वितरण और लौकिक गतिशीलता दोनों के बारे में जानकारी प्रदान करता है। प्रकोष्ठों कुशलतापूर्वक झिल्ली पारगम्य फ्लोरोसेंट संकेतकों और अनुकूलित धुंधला प्रोटोकॉल ²¹ का उपयोग करके एक न्यूनतम इनवेसिव तरीके से सना हुआ जा सकता है। इस vivo में के रूप में ²³ के रूप में अच्छी तरह से, कार्यात्मक संरक्षित तैयारी ^14-16,22 में एक न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या और आंतों का glia की निगरानी करने का अवसर प्रदान करता है। पूरे माउंट ऊतक तैयारी ऐसी सीए ^{2 +} करने के लिए बाध्य है, जब इसकी प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है कि Fluo-4 के रूप में एक उच्च आत्मीयता सीए ^{2 +} सूचक डाई के साथ भरी हुई थोक हैं। प्रतिदीप्ति में परिवर्तन एक सीसीडी कैमरा और एना द्वारा दर्ज की गई हैंडिजिटल ⁶ lyzed। सीए ^{2 +} के आगमन के विभिन्न उत्तेजनाओं को न्यूरॉन और glia सेल बातचीत, जवाबदेही की निगरानी करने का अवसर है, और वास्तविक समय में जठरांत्र प्रक्रियाओं में इन प्रकार की कोशिकाओं की भागीदारी प्रदान की है।

बगल में सीए ^{2 +} इमेजिंग आंतों का न्यूरॉन्स और glia की संकेतन तंत्र में महान अंतर्दृष्टि प्राप्त हुए है और सेल संस्कृति मॉडल ^6,24 पर कई अलग फायदे के पास। सबसे पहले, बगल में तैयारी न्यूरॉन्स और glia की देशी मैट्रिक्स पर्यावरण को बनाए रखने और बरकरार ऊतक लक्षित करने के लिए उनके कनेक्शन के थोक छोड़ दें। दूसरा, आनुवंशिकी और सुसंस्कृत आंतों का glia की आकृति विज्ञान काफी vivo में ^6,24 की तुलना में बदल रहे हैं। तीसरा, कई heterotypic बातचीत प्राथमिक सेल संस्कृति में खो दिया है और सेल सेल बातचीत का आकलन करने के लिए इस सीमा रहे हैं। संवर्धित कोशिकाओं में अच्छी तरह से मौलिक गुणों की जांच, उनके usefulne के लिए अनुकूल हैं यद्यपिआंतों का glia और न्यूरॉन्स के बीच जटिल संबंधों के अध्ययन के लिए एस एस सीमित है। अन्तर्ग्रथनी रास्ते ²⁵ बरकरार रहेगा के रूप में एक बगल में दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच कर न्यूरॉन glia परस्पर क्रिया अधिक physiologically प्रासंगिक है। सेल संस्कृति के दृष्टिकोण की तुलना में, सीटू दृष्टिकोण में एक व्यवस्थित ढंग से न्यूरॉन्स और आंतों का glia के बीच जटिल बातचीत को समझने के लिए बेहतर स्थिति प्रदान करता है। इसके अलावा, पूरे माउंट तैयारी में ganglionated जाल के तलीय संगठन इंट्रासेल्युलर सीए ^{2 +} यात्रियों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए आदर्श है और इस तकनीक को सत्ता में न्यूरॉन glia गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है।

Protocol

नोट: प्रयोगशाला जानवरों से ऊतक को शामिल निम्न कार्यविधियों पशु 2013 की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशानिर्देश के साथ संगत कर रहे हैं और मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी IACUC द्वारा अग्रिम में अनुमोदित किया गया। 1. ऊतक तैयारी ऑक्सीजन में या एक शारीरिक बाधा isoflurane के साथ सीधे संपर्क में आने से पशुओं को रोकता है, यह सुनिश्चित करने के कक्ष के फर्श पर एक शोषक सामग्री पर तरल isoflurane की 3-5 मिलीलीटर रखकर 2.5 isoflurane% से युक्त एक कक्ष में अनुसंधान पशु anesthetize। लुटेरा pinching द्वारा संज्ञाहरण की गहराई के लिए टेस्ट। नोट: पिछले अंग की कोई वापसी पलटा है जब वहाँ संज्ञाहरण की गहराई उचित समझा है। उचित anesthetized एक बार, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ पेट की त्वचा साफ। Midline पर पेट की त्वचा चुटकी संदंश का प्रयोग करें और एक 6 सेमी मीडिया बनाने के लिए शल्य कैंची का उपयोगLINEA अल्बा के साथ एल चीरा आंतरिक पाचन अंगों को बेनकाब करने के लिए। पता लगाने और पेरिटोनियम अंदर लघ्वान्त्र बेनकाब करने के लिए कुंद संदंश का प्रयोग करें। कैंची से ileal / पेट के अन्त्रपेशी काटें और आंत unraveling शुरू करते हैं। आंत की लंबाई पर्याप्त रूप से सुलझाया है, एक बार एक लघ्वान्त्र तैयारी के लिए cecum करने के लिए पेट और समीपस्थ को आंत बाहर का काटा। एक बड़ी आंत की तैयारी के लिए, मलाशय के लिए अंधान्त्र और समीपस्थ को पेट के बाहर काटा। जल्दी से आंतों खंड को हटाने और तीन माइक्रोन nicardipine हाइड्रोक्लोराइड और 1 माइक्रोन scopolamine हाइड्रोक्लोराइड के साथ पूरक DMEM / F12 मीडिया के साथ एक बीकर में जगह बर्फ पर (इसके बाद "मीडिया" के रूप में करने के लिए कहा गया है)। इन अवरोधकों के अलावा पेट चिकनी पेशी लकवाग्रस्त द्वारा microdissection और बाद इमेजिंग की सुविधा। स्थापित संरचनात्मक मार्करों के आधार पर ब्याज की कट खंड (जैसे, सूखेपन, लघ्वान्त्र, बाहर का या समीपस्थ कोलोन)। आमतौर पर भीतर का उपयोगबाहर का लघ्वान्त्र या बाहर का बृहदान्त्र से ई ऊतक। हालांकि, सभी आंतों क्षेत्रों में, लोड और छवि myenteric न्यूरॉन्स और glia अलग करने के लिए एक ही मूल प्रक्रिया का उपयोग करें। ठंडा मीडिया के साथ भरा एक Sylgard लेपित पेट्री डिश में वांछित आंत खंड और जगह के एक छोटे से क्षेत्र (4-6 सेमी) निकालें। समीपस्थ और कीट पिन के साथ आंतों खंड के बाहर का सिरों को सुरक्षित और एक सीधे बनाकर आंतों ट्यूब खोलने, लंबाई मेसेंतेरिक सीमा के साथ काटा। ठीक संदंश (# 5 और # सबसे अच्छा 5/45 काम) और बहुत ठीक वसंत कैंची का उपयोग श्लैष्मिक परत दूर काटना ऊपर और ध्यान से म्यूकोसा पक्ष के साथ प्रकाश तनाव के तहत फ्लैट पिन ऊतक। नोट: ठीक से नहीं किया अगर म्यूकोसा को हटाने की सत्ता के लिए काफी दर्दनाक हो सकता है। गुणवत्ता की तैयारी के लिए, छीलने या scraping द्वारा म्यूकोसा के अचानक हटाने को सीमित करने का ख्याल रखना। सबसे अच्छा अभ्यास म्यूकोसा उठा और ठीक कैंची के साथ नीचे काट रहा है। छोटे तैयारी में ऊतक में कटौतीएस इमेजिंग बर्तन में (लगभग 0.5 सेमी 2) और पिन ताजा मीडिया के साथ बर्फ पर रखा गया (परिपत्र मांसपेशी परत का सामना करना पड़ के साथ चार कोनों)। ध्यान से myenteric जाल का पर्दाफाश करने के लिए ठीक चिमटी के साथ अलग चिढ़ा द्वारा परिपत्र मांसपेशी दूर काटना। अत्यधिक खींच से बचें। ताजा मीडिया के साथ बर्फ और परिवर्तन के समाधान पर वापस इमेजिंग पकवान रखें। पकवान प्रति एंजाइम मिश्रण के 2 मिलीलीटर की तैयारी [Dispase 1 यू / एमएल (4.48 मिलीग्राम / 8 मिलीग्राम), Collagenase प्रकार द्वितीय 150 यू / एमएल (5.45 मिलीग्राम / 8 मिलीग्राम) मीडिया में]। बर्फ से बर्तन निकालें और कदम 1.13 से एंजाइम मिश्रण जोड़ें। 5% सीओ 2/95% हवा के साथ 15 मिनट के लिए आरटी पर बर्तन सेते हैं। मीडिया में 3 बार और फिर से पिन कोनों से धो लें ऊतक तैयारी। 2. लोड हो रहा है Fluo-4 डाई नोट: सूचक रंगों के साथ भरी हुई फ्लोरोसेंट रंगों और ऊतक से निपटने जबकि सीमित प्रकाश के साथ काम करके photobleaching से बचें। चार माइक्रोन Fluo-4 लोड हो रहा है समाधान तैयार है। 4 मिमी Fluo-4 शेयर के 1.5 μl विभाज्य के लिए 1.5 मिलीलीटर मीडिया और एक 250 मिमी प्रोबेनेसिड स्टॉक के 1.2 μl जोड़ें। Fluo-4, पूर्वाह्न 50 माइक्रोग्राम प्रति के लिए, (0.25% cremaphor-ईएल के साथ पूरक DMSO में 20%) 4 मिमी Fluo-4 शेयर pluronic एफ-127 की 11.4 μl जोड़कर तैयार किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए Fluo-4 लोड हो रहा है समाधान में preps सेते हैं। इनक्यूबेटर से निकालें और मीडिया 3 बार के साथ तैयारी धो लें। मीडिया 200 माइक्रोन प्रोबेनेसिड युक्त और इमेजिंग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते के लिए एक्सचेंज मीडिया। नोट: प्रोबेनेसिड न्यूरॉन्स में बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टरों को रोकता है कि एक दवा है। इस दवा के अलावा रंगों हटा न्यूरॉन्स की क्षमता रोकता और neuronal लेबलिंग को बढ़ाता है। प्रोबेनेसिड के अभाव में सीए 2 + सूचक रंगों के थोक लोडिंग मुख्य रूप से glial सेल लोड हो रहा है पैदा करता है। प्रोबेनेसिड के अलावा neuronal और glial प्रतिक्रियाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। तैयार करें Kre संशोधितबी एस बफर। बनाओ घटकों के (मिमी में) अंतिम सांद्रता के रूप में पीछा कर रहे हैं कि एक संशोधित क्रेब्स बफर ऐसे: 121 सोडियम क्लोराइड, 5.9 KCl, 2.5 2 CaCl, 1.2 2 MgCl, 1.2 नाह 2 पीओ 4, 10 HEPES, 21.2 3 NaHCO, एक पाइरुविक एसिड और (NaOH के साथ 7.4 करने के लिए समायोजित पीएच) 8 ग्लूकोज। सीए के दौरान 2 + इमेजिंग मांसपेशी संकुचन को बाधित करने के लिए 3 माइक्रोन nicardipine और 1 माइक्रोन scopolamine जोड़ें और dissections के पूरे माउंट। 3. इमेजिंग और विश्लेषण नोट: एक फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, माइक्रोस्कोप, एक गुणवत्ता सीसीडी कैमरा और उपयुक्त अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ कम से कम एक बुनियादी इमेजिंग रिग का प्रयोग करें। प्रकाश स्रोत और विशिष्ट आवेदन के आधार पर अन्य घटकों के अलावा अलग-अलग हो। एक फिल्टर पहिया और शटर एक पारंपरिक क्सीनन चाप प्रकाश स्रोत के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हालांकि, एलईडी प्रकाश स्रोतों और रोशनी प्रणालियों उन घटकों की आवश्यकता नहीं है। आरईसी स्थित करेंखुर्दबीन के नीचे कक्ष ording और कई गर्म सिरिंज जलाशयों के साथ एक गुरुत्व प्रवाह छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस क्रेब्स बफर के 2-3 मिलीग्राम / मिनट की एक सतत छिड़काव दर की स्थापना। एक निर्वात फंसाने के लिए लॉग इन दोनों इनपुट और चूषण लाइन में हवा बुलबुला बनने से रोकने के लिए सुनिश्चित करें। उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत ध्यान में वांछित जाल लाओ। तस्वीर विरंजन को जन्म दे सकती है जो ऊतक, overexposing से बचें। गैन्ग्लिया के भीतर Fluo-4 लोड हो रहा है की जांच करने और इमेजिंग के लिए स्वस्थ गैन्ग्लिया का चयन करें। अस्वस्थ / क्षतिग्रस्त गैन्ग्लिया autofluorescence या कबरा आकृति विज्ञान प्रदर्शन करेंगे और इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। नाड़ीग्रन्थि चयनित होने के बाद, कैमरे के लिए प्रकाश पथ हटाने और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ लाइव छवि प्राप्त करते हैं। कि नाड़ीग्रन्थि ध्यान केंद्रित करने और सेट छवि अधिग्रहण की दर और जोखिम बार में है सुनिश्चित करें। नोट: छवि अधिग्रहण दरों और टाइम्स जांचकर्ताओं को रिकॉर्ड करने के लिए इच्छा की घटनाओं के आधार पर अलग अलग होंगे। सबसे प्रयोगों, छवियों के लिएglial सीए 2 + प्रतिक्रियाओं सीए न्यूरॉन्स में 2 + यात्रियों के रूप में के रूप में तेजी से नहीं कर रहे हैं क्योंकि पारंपरिक रूप से न्यूरॉन्स के लिए 2-10 हर्ट्ज के लिए glial कोशिकाओं के लिए 0.5-1 हर्ट्ज पर और ऊपर से अर्जित कर रहे हैं। प्रयोग शुरू किया और 30 सेकंड के लिए आधारभूत गतिविधि की स्थापना। ऐसे में 2-3 मिलीग्राम / मिनट की दर से गुरुत्वाकर्षण प्रवाह छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर रिसेप्टर एगोनिस्ट और विरोधी के रूप में ब्याज की पूर्व गर्म दवाओं पर लागू करें। सामान्य बफर का छिड़काव करने के लिए लौटने से एगोनिस्ट / विरोधी के आवेदन का पालन करें और कम से कम 10 मिनट की एक धोने / वसूली की अवधि के लिए अनुमति देते हैं। नोट: दवा आवेदन टाइम्स व्यक्ति यौगिक और प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग अलग होंगे। सामान्य में, एगोनिस्ट के 20-30 सेकंड आवेदन न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं में जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, (जैसे कि निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स के रूप में) ligand-गेटेड आयन चैनल से अधिक नहीं 5-10 सेकंड के आवेदन टाइम्स की आवश्यकता होती है। इसके अलावा अवधि जोखिम ligand gated आयन चैनल तेजी से इन करने के लिए कारण होगाnsitize। गरम रिसेप्टर रास्ते की पूरी नाकाबंदी सुनिश्चित करने के लिए लगभग 3-15 मिनट के लिए लागू किया जाना चाहिए। बहरहाल, यह एक सकल सामान्यीकरण है और जांचकर्ताओं को हमेशा अपने विशेष प्रतिमान में किसी भी प्रयोगात्मक दवा का अनुकूलन करना चाहिए। प्रयोग की रिकॉर्डिंग और देखें फिल्म समय चूक बंद करो। उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज के ध्यान से चुनिंदा क्षेत्रों (आरओआई) की। मानक के अनुसार और अपनी प्रारंभिक आधारभूत फ्लोरोसेंट मूल्य के खिलाफ आरओआई फ्लोरोसेंट तीव्रता तुलना करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति में परिवर्तन [सीए 2 +] में बदलाव के लिए सीधे आनुपातिक हैं। आरओआई – ΔF / एफ = (एफ 0) / एफ 0 (एफ 1) – का उपयोग करते हुए पहले से 26 में वर्णित एक विधि के एक संशोधन का उपयोग करें ((एफ 1 – एफ 0) / एफ 0) एफ 1 प्रतिदीप्ति किसी भी पर है, जहां पृष्ठभूमि, बिंदु और F0 आकलन सटीकता में सुधार करने, आधारभूत प्रतिदीप्ति है। इस संशोधन एड्सmyenteric जाल अंतर्निहित मांसपेशियों परत का आंदोलन है कि प्रदर्शन के ऊतकों की तैयारी में प्रतिदीप्ति परिवर्तन से शोर को कम करने में।

Representative Results

इस तकनीक के समुचित उपयोग के ऊतकों की तैयारी माउंट पूरे जांचकर्ताओं सही रूप से intracellular सीए 2 + [सीए 2 +] मैं आंतों का न्यूरॉन्स में यात्रियों और में glia को मापने के लिए अनुमति देता है। माउस बृहदान्त्र से एक myenteric नाड़ीग्रन्थि भीतर glia में एक agonist पैदा सीए 2 + प्रतिक्रियाओं का एक प्रतिनिधि उदाहरण 1 वीडियो में दिखाया गया है। निम्न परिणाम है कि हम इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त किया है कुछ प्रतिनिधि परिणाम को वर्णन करने के लिए होती हैं। सबसे पहले, चित्रा 2 आंतों का glial को मापने के लिए एक प्रयोग के परिणाम दिखाता है [सीए 2 +] मैं गिनी पिग colonic अनुदैर्ध्य myenteric मांसपेशी जाल (LMMP) की तैयारी के भीतर एटीपी द्वारा उत्तेजना के जवाब में बदल जाता है। विशेष रूप से, यह आंकड़ा विश्लेषण किया myenteric नाड़ीग्रन्थि और आंतों का न्यूरॉन्स के स्थान denoting तारक की रूपरेखा सहित ऊपर सूचीबद्ध प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उचित विश्लेषण के लिए विधि से पता चलता है। इसके अलावा इन परिणामों मैं[सीए 2 +] मैं गिनी पिग में myenteric glia के जुटाव पर एक सौ micromolar एटीपी के इष्टतम खुराक llustrate। यह प्रतिक्रिया आंतों का glial उत्तेजना जांचना और उत्तेजनाओं का परीक्षण करने के लिए प्रतिक्रियाओं को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अगला, चित्रा 3 ठीक से ब्याज (ROIs) glial कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्रों का चयन करने के लिए कैसे elucidates, पीले हलकों के आसपास के साथ दिखाया गया है। इन परिणामों से भी बेसल शर्तों के तहत और औषधीय उत्तेजनाओं के जवाब में वांछित प्रतिदीप्ति परिवर्तन दिखा। अंत में, चित्रा 4 पूरे माउंट तैयारी में [सीए 2 +] मैं प्रतिक्रिया के लिए आंतों का glia और न्यूरॉन्स को चुनने के लिए स्थानिक विचार को दर्शाता है। सत्ता की चित्रा 1. संगठन। सत्ता के दो प्रमुख ganglionated चक्रों में शामिल है। myenteric जाल एल के बीच स्थित हैongitudinal और परिपत्र मांसपेशी परतों। submucosal जाल म्यूकोसा और परिपत्र मांसपेशी परत के बीच स्थित है। सत्ता केवल न्यूरॉन्स और आंतों का glia के शामिल है। नर्व फाइबर इलाकों गैन्ग्लिया कनेक्ट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। गिनी पिग colonic myenteric जाल जवाब में चित्रा 2. आंत्र glia सीटू में एटीपी के लिए। (ए) एक myenteric नाड़ीग्रन्थि में Fluo-4 प्रतिदीप्ति बेसल शर्तों के तहत (धराशायी लाइन द्वारा उल्लिखित)। तीर 100 μmol / एल एटीपी, glial कोशिकाओं के साथ उत्तेजना पर (बी)। मोटी interganglionic फाइबर इलाकों को इंगित, लेकिन नहीं न्यूरॉन्स, तेजी से वृद्धि Fluo-4 [2 Ca +] में वृद्धि का संकेत प्रतिदीप्ति <sयूबी> मैं। प्रत्युत्तर देना कोशिकाओं छोटे हैं कि नोट और (तारक से चिह्नित अंधेरे रिक्त स्थान) बहुत बड़ा न्यूरॉन्स के चारों ओर। (सी) आंत्र glia एक mmol / एल अधिक से अधिक प्रतिक्रियाएं 24 eliciting के साथ एक खुराक पर निर्भर तरीके से एटीपी का जवाब। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण। सीटू में एटीपी को colonic myenteric जाल जवाब में चित्रा 3. Murine एस-100-GFP + कोशिकाओं। (ए) एस-100-+ GFP एक माउस colonic myenteric नाड़ीग्रन्थि में glial कोशिकाओं (हरा) (धराशायी लाइन द्वारा उल्लिखित)। ब्याज (ROIs) गैन्ग्लिया के भीतर glial कोशिकाओं आसपास के छह क्षेत्रों पीले हलकों के रूप में दिखाया जाता है। तीर नाड़ीग्रन्थि में अग्रणी मोटी फाइबर इलाकों से संकेत मिलता है। तारक डीदो आंतों का न्यूरॉन्स की eNote स्थान। (बी) बेसल शर्तों के तहत Rhod-2 प्रतिदीप्ति दिखा ही नाड़ीग्रन्थि। (सी) 100 μmol / एल एटीपी के साथ उत्तेजना के बाद, glial कोशिकाओं [सीए 2 +] मैं रूप में वृद्धि हुई Rhod- द्वारा दिखाया वृद्धि के साथ जवाब दो प्रतिदीप्ति। (घ) एक-सी में दिखाया प्रत्येक रॉय के लिए इसी बताते हैं। (ई) डी 24 में दिखाया 6 ROIs की प्रतिक्रिया (SEM ± मतलब है) औसत। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। आंतों का न्यूरॉन-टू-glia संचार के सीटू इमेजिंग में 4 चित्र। एक सीए 2 + इमेजिंग प्रयोग से (ए) प्रतिनिधि छवियों (pseudocolored) जहां एक पूरे माउंटmyenteric जाल की तैयारी न्यूरोनल P2X7 रिसेप्टर agonist BzATP (100 माइक्रोन, 30 सेकंड) के साथ चुनौती दी गई थी। न्यूरोनल एगोनिस्ट आसपास के आंतों का glial कोशिकाओं (ए ") के लिए पहले न्यूरॉन (ए ') में Fluo4 प्रतिदीप्ति में वृद्धि का कारण बनता है कि ध्यान दें। (बी) glia (नीला) और न्यूरॉन्स में समय पर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का विश्लेषण (लाल ) सामान्य बफर (ठोस लाइनों में BzATP को न्यूरोनल एगोनिस्ट, BzATP। (सी) neuronal और glial प्रतिक्रियाओं के आवेदन के बाद) और बफर में neuronal P2X7 रिसेप्टर्स 13 शक्ति प्रदान करने के लिए कम Ca 2 और 2 मिलीग्राम + (धराशायी लाइनों) युक्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। में आंतों का glia में वीडियो 1. Agonist पैदा सीए 2 + प्रतिक्रियासीटू। यह वीडियो सीए 2 + सूचक डाई, fluo-4 के साथ भरी हुई माउस बाहर का बृहदान्त्र से एक myenteric नाड़ीग्रन्थि से पता चलता है। संकेत दिया जब glial सेल एगोनिस्ट, ADP, स्नान के लिए कहा जाता है। ADP के Fluo-4 प्रतिदीप्ति में क्षणिक ऊंचाई से मनाया के रूप में आंतों का glia में intracellular सीए में वृद्धि 2 + elicits। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca²⁺ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.

In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.

Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations ²⁷. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP ². The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus ²⁸. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.

In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis ²⁹. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

Materials

Name	Company	Catalog Number
BubbleStop Syringe Heater	AutoMate Scientific	10-4-35-G
CaCl2	Sigma	C3306
Collagenase, Type II, powder	Gibco	17101-015
Dispase	Sigma-Aldrich	42613-33-2
Dissection tools	Roboz
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Fixed-stage microscope	Olympus	BX51WI
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
Insect pins	Fine Science Tools	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
KCl	Sigma	P3911
MgCl2	Sigma	M9272
NaCl	Sigma	S9888
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Perfusion chamber	Custom
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecular Probes	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C