Experimentell Bedömning av mus Sällskaplighet hjälp av en automatiserad bildbehandling Approach

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att kvantifiera mus sällskaplighet. Möss videofilmas när de rör sig och interagerar i en särskild bur. Filmbearbetning möjliggör den automatiserade kvantifiering av sociability med utmärkt noggrannhet och tillförlitlighet.

Abstract

Musen är den föredragna modellorganism för att testa läkemedel som syftar till att öka trevnad. Vi presenterar en metod för att kvantifiera mus sällskaplighet i vilket test mus placeras i en standardiserad apparat och relevanta beteenden bedöms i tre olika sessioner (kallas sessions I, II, och III).

Apparaten har tre fack (se figur 1), innehåller en inverterad bägare som rymmer en mus (som kallas "stimulus mus") vänster och höger fack.

I session I skall testmus placeras i buren och dess rörlighet kännetecknas av antalet övergångar som har gjorts mellan fack. I session II, en stimulus mus placeras under en av de inverterade koppar och den sociala biten av test musen kvantifieras med de belopp tid det spenderar nära koppen innehåller den medföljande stimulans musen mot den tomma inverterade koppen. I session III, är de inverterade kopparna bort en d både möss interagera fritt. Den sociala biten av test musen i session III kvantifieras genom antalet sociala strategier det gör mot stimulans musen och antalet gånger man undviker en social strategi från stimulans musen.

Den automatiserade utvärdering av filmen detekterar nos testmus, vilket medger bestämning av alla beskrivna Sällskaplighet åtgärder i sessionen I och II (i session III skall tillvägagångssätt identifieras automatiskt men som klassificeras manuellt). För att hitta näsan, är bilden av en tom bur digitalt subtraheras från varje bildruta i filmen och den resulterande bilden är binär att identifiera musen pixlar. Musen svans automatiskt bort och de två mest avlägsna punkter för de kvarvarande mus bestäms; dessa är nära näsa och svansroten. Genom att analysera rörelsen hos musen och med användning av kontinuitets argument, är näsan identifieras.

"Figur 1" src = "/ filer / ftp_upload / 52.508 / 52508fig1.jpg" />
Figur 1. Bedömning av Sällskaplighet Under 3 sessioner Session I (överst).. Acklimatisering av test mus till buren Session II (mitten). Test mus röra sig fritt i buren medan stimulans musen är innesluten i en inverterad kopp Session III (botten): Både prov mus och stimulans mus tillåts röra sig fritt och interagera med varandra.

Introduction

Nedsatt sällskaplighet är en av de primära symptom domäner i en rad störningar av nervsystemets, inklusive autismspektrumstörningar (ASD) ^1,2. Det begränsar allvarligt patienternas förmåga att utveckla relationer och kraftigt påverkar patienter, familjer och vårdgivare ^2,3.

I ett försök att bättre förstå mekanismen bakom försämrad sällskaplighet och utveckla behandlingar har flera musmodeller studerats ^1,4-9. En sådan stam är Balb / c-mus, en inavlad stam som uppvisar påfallande låg sällskaplighet, som liknar funktioner ses hos patienter med ASD5 ^8-12. Till exempel visar BALB / c-mus en lägre frekvens av sociala metoder och en vanligtvis negativt svar på sociala strategier genom en stimulus mus (t.ex. social undvikande) än den schweiziska Webster jämförelse stam ^10.

För att testa om en föreslagen behandling är effective öka sällskaplighet behövs objektiva mått. En allmänt accepterad ram är att analysera den sociala biten i ett standardiserat anordning som har tre fack (se figur 1).

De vänstra och högra fack vardera innehåller en inverterad tråd cup som inrymmer ett socialt framträdande stimulans mus. Test musknappen släpps in i anordningen i tre intervaller av 10 min (sessioner I-III); session I bedömer rörelseaktiviteten hos test mus, medan sessioner II och III utvärdera olika aspekter av testet musens sällskaplighet.

I session I skall testmus får acklimatisera till anordningen. I denna session, är antalet övergångar att test musen gör mellan de olika avdelningarna mäts. Viktigt är sällskaplighet åtgärder som erhållits i standard tre fack apparat beroende rörelseaktivitet och minskad rörelseaktivitet kan förbrylla tolkningen av sociförmåga data.

I session II testet musen röra sig fritt och en stimulans mus placeras under en av de inverterade koppar (motvikts). Stimulans möss är fyra veckor gamla utavlade ICR möss, ålders- och könsmatchade till testmöss. Stimulans musen är innesluten i en inverterad kopp i den sida som betecknas som den sociala utrymmet, och en tom inverterad kopp är placerad i den sida som betecknas som den nonsocial utrymmet. I session II den sociala biten av test musen kvantifieras genom att jämföra den tid man spenderar nära "social" inverterad kopp (mindre än 2 cm) vs tid man spenderar nära "nonsocial" inverterade koppen, och när det tillbringar i social facket mot den tid det tillbringar i nonsocial facket. Swiss Webster jämförelsemöss tillbringar betydligt mer tid i det sociala facket och nära sociala inverterade koppen jämfört med BALB / c-möss som inte visar någon signifikant preferens för socialainverterad kopp eller sociala facket ^12.

I session III, provnings- och stimulans möss tillåts att interagera fritt (inverterade koppar avlägsnas). Åtgärder av sällskaplighet, stereotypa beteenden och övergångar mellan fack tillförlitligt erhålls i den tredje 10 min session fri växelverkan mellan prov och stimulans möss och analyserades. I denna rapport, är den sociala biten av test mus kvantifieras via två åtgärder: 1) antalet sociala strategier det gör mot stimulans mus, där en social strategi definieras som rör sig framåt (nosen först) mot stimulans musen så att näsa är mindre än 2 cm från stimulans mus; 2) antalet undvikanden av sociala metoder vid stimulans musen. Testet musen anses undvika strategi om det visar eller flyttar bort från stimulus mus, eller om det tillfälligt slutar röra ( "frysning beteende") efter stimulans musen har närmat testet musen. BALB /c-möss visar en minskning av antalet sociala strategier som gjorts mot stimulans mus och en ökning av antalet negativa svar på sociala åtgärder från stimulans mus, jämfört med den schweiziska Webster jämförelse stam ^10.

Utvärderingen av beteende filmer har traditionellt gjorts manuellt, det vill säga genom att titta på filmen noggrant (möjligen med reducerad hastighet) och aktivera stoppur för den tid musen tillbringar i en viss avdelning eller i närheten av en av de inverterade kopparna ^10. Denna metod kräver att titta på filmen flera gånger och är därför mycket tidsödande. Dessutom är noggrannheten begränsad av kodarens reaktionstid för stoppuret mätningar och förmåga att uppfatta huruvida musen är inom 2 cm av den inverterade koppen. I senare arbete, två föreningar, (D-serin och D-cykloserin) har visat sig vara effektivt för att återställa sociability i BALB / c-möss ^9,10,12. Det är känt att både komponenter modusen NMDA-receptorn, som är känd för att spela en central roll i socialt beteende ^2,12. En stor mängd föreningar är känd för att modulera NMDA-receptoraktivitet i en mängd olika väl definierade sätt, och potentialen för ett genombrott i ASD behandling gör skyndsam utvärdering av dessa föreningar en prioritet och en snabb automatisk metod för utvärdering högst önskvärt.

Nedan beskrivs en automatisk analysförfarandet utvecklats för bedömning av mus sällskaplighet. Den använder bildbehandlingsmetoder på alla ramar av musen filmer för att identifiera positionen för mus eller möss. I sessioner I och II, upptäcker ytterligare näsa ställning och använder den för att beräkna sällskaplighet åtgärder. I session III, upptäcker automatiskt alla metoder, men manuell klassificering (social strategi, social undvikande, eller annat) krävs.

Protocol

Protokollet för att underlätta förklaringen har delats upp i 2 delar: 1) Försöksförfarande och 2) Automatiserad analys. Samtliga djur behandlades enligt handledningen för vård och användning av försöksdjur 15, och alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Försöksförfarande Ställ in i buren, som är en svart icke-reflekterande Plexiglas rektangulär låda (52 x 25 x 23 cm 3) uppdelad i tre avdelning…

Representative Results

Figur 3 visar ett färg ram i en beteende film med en tom bur. Musen har inte införts i buren ännu. Placeringen av koppar, (sociala och nonsocial) och utrymmet gränserna är överlagrade. Färgen ram tom bur omvandlas till 8 bitars gråskala som visas i figur 4 och används som en referensram. Referensramen subtraheras från varannan ram från den inspelade filmen. Figur 5 visar en av ramarna från filmen under sessionen I, återigen med …

Discussion

Genom att kombinera videofilmning möss och automatisk filmanalys, har vi skapat en prisvärd, pålitlig high-throughput screening teknik.

Riktigheten i den automatiserade analysen jämfördes med resultaten av manuell analys för mer än 100-filmer. I den överväldigande majoriteten av ramar (> 99%) av ramar, är näsan av musen identifieras med god precision. De flesta av de (få) misdetections har ingen effekt på den sociala biten åtgärder så att omkring 80% av filmerna inte kräv…

Materials

Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.