Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

Summary

Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.

Abstract

L’imagerie par ultrasons peut transmettre des informations quantitatives essentielles concernant la vascularisation et la perfusion tissulaires et, dans des applications ciblées, faciliter la détection et la mesure de biomarqueurs vasculaires au niveau moléculaire. Dans l’embryon de souris, cette technique non invasive peut être utilisée pour découvrir les mécanismes de base sous-jacents au développement vasculaire dans le système circulatoire précoce de la souris et dans des modèles génétiques de maladies cardiovasculaires. L’embryon de souris se présente également comme un excellent modèle pour étudier l’adhésion des microbulles à des cibles angiogéniques (y compris le récepteur 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR2) ou α_{v β3}) et pour évaluer la nature quantitative de l’échographie moléculaire. Nous avons donc développé une méthode pour introduire des agents de contraste à ultrasons dans le système vasculaire d’embryons vivants et isolés. Cela permet une liberté en termes de contrôle et de positionnement de l’injection, de reproductibilité du plan d’imagerie sans obstruction ni mouvement, et une analyse et une quantification simplifiées de l’image. À la fin de la gestation (jour embryonnaire (E)16.6 et E17.5), des embryons murins ont été isolés de l’utérus, doucement extériorisés du sac vitellin et des agents de contraste à microbulles ont été injectés dans les veines accessibles à la surface chorionique du disque placentaire. L’imagerie par ultrasons de contraste non linéaire a ensuite été utilisée pour recueillir un certain nombre de paramètres de perfusion de base (augmentation du pic, taux de lavage et temps jusqu’au pic) et quantifier la liaison ciblée des microbulles dans un modèle murin d’endogline. Nous montrons la circulation réussie des microbulles dans les embryons vivants et l’utilité de cette approche dans la caractérisation du système vasculaire embryonnaire et du comportement des microbulles.

Introduction

échographie de rehaussement du contraste permet l'utilisation d'agents de contraste à microbulles de visualiser et caractériser l'environnement vasculaire. Ces agents permettent l'évaluation non invasive de la microcirculation, la vascularisation et la fonction cardiovasculaire. En outre, la modification de la surface de la bulle peut conduire à la liaison à microbulles ciblée biomarqueurs endotheliales, comme démontré dans des applications précliniques de l'angiogenèse, l'athérosclérose et l'inflammation faisant ^1,2 imagerie par ultrasons moléculaire des événements vasculaires possibles. Échographie de contraste amélioré peut d....

Protocol

REMARQUE: Les procédures expérimentales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soins des animaux au Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procédures pour le traitement sans cruauté des animaux doivent être respectées en tout temps. Il est supposé que l'enquêteur est formé dans le fonctionnement de base d'un système d'imagerie par ultrasons. Ce protocole fonctionne mieux avec deux personnes.

1. Modèles animaux

1. Compagnon CD-1 mâle et femelle Mus musculus d'obtenir des embryons de type sauvage pour les études de perfusion.
2. Pour les études d'imageri....

Results

L'injection d'agents de contraste ultrasonore dans ex utero des embryons de souris dépend de l'isolement réussi de vie, les embryons au stade gestationnel tardif de l'utérus et le maintien de la viabilité au cours de l'injection et l'imagerie par ultrasons associée. Une fois que l'embryon a été extériorisé et positionné, comme le montre la figure 1, l'injection soigneuse de l'agent de contraste dans le système vasculaire embryonnaire est possible. Une image ultrasonore en mode B typique d'un em.......

Discussion

Ultrasons agents de contraste ont été injectés dans des embryons de souris gestation stade avancé et des images de contraste non linéaires ont été acquis pour mesurer les paramètres de perfusion et de microbulles ciblées contraignant. Imagerie réussie des microbulles à l'intérieur du système vasculaire embryonnaire était dépendant d'un certain nombre de facteurs, le premier étant embryon viabilité. Tous les équipements et appareils ont été préparées à l'avance afin de minimiser le temps nécessaire pour l'.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
réactifs<
rat IgG2 contrôle	eBioscience	13-4321-85	Cette combinaison anticorps/microbulle est souvent nécessaire comme contrôle expérimental  ;
biotine anti-souris CD309	eBioscience	13-5821-85
Anticorps de rat biotinylé MJ 7/18 contre l’endogline de souris	Hybridome		anticorps extérieurs peuvent également être appropriés : nous avons utilisé eBioscience (13-1051-85 ) dans le passé
Eau
Milieu embryonnaire
500 ml Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen avec une glycémie élevée	Sigma	D5796
50 ml Sérum de veau fœtal	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140-122	5 ml, 10 000 unités Pen., 10 000 μ ; g Éthanol streptococcique
, 70 %
de paraformaldéhyde	de
solution saline tamponnée au phosphate [1x]  ;	Sigma	D8537	1x, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium
Souris enceinte, CD-1	Charles River Laboratories Inc.  ;
Chlorure de sodium à 0,9 % (solution saline)	Hospira	0409-7984-11
Agent de contraste à ultrasons, prêt à cibler et non ciblé	Micromarqueur ; VisualSonics Inc.
Gel à ultrasons (Aquasonic 100, incolore)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Plaques de culture cellulaire (4) :  ; 100  ; x  ; 20  ; mm	Fisher Scientific	08-772-22
Plaques de culture cellulaire (12) : 60  ; x  ; 15  ; mm	Sigma	D8054
Centrifugeuse	Sorvall Legend RT centrifugeuse  ;
Tubes coniques, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluant	Beckman Coulter	Isoton II, 8448011
Ciseaux de dissection (Wagner)	Outils de science	fine Wagner 14068-12
Pince (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)	Outils de science fine	11200-33
Pince à éclats	VWR	25601-134
Bécher en verre, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Capillaires en verre, 1 x 90  ; mm GD-1 avec filament	Narishige	GD-1
Extracteur d’aiguille en verre	Narishige	PN-30
Gants	Ansell	4002
Sonde d’anatomie générale	Outils de sciences fines	10088-15
Plaque chauffante	VWR	89090-994
Seau à glace	Cole Parmer	RK 06274-01
Imagerie Plateforme	VisualSonics Inc.		de rail intégré
Source lumineuse, fibre optique	Fisher Scientific	12-562-36	Idéalement a des bras réglables
Luers (12), polypropylène barbelé femelle ¼ ;-28 Filetage UNF	Cole Parmer	45500-30
Micro-système d’échographie, haute fréquence	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Aiguilles, calibre 21 (1 po)	VWR	305165
Analyseur de taille de particules	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter Cuillère
perforée (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Broches (6), anodisé noir minutien 0,15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μ ; l, 20-200 μ ; l, 100-1 000 μ ; l]	Eppendorf	Research Plus  ; 3120000038 réglable ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 3120000054;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Pointes de pipette [2-200  ; μ ; l, 50-1 000  ; μ ; l]	Eppendorf	epT.I.P.S.  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 22491334;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Ciseaux
Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32 » x 3/32 »	VWR	63010-007
Bâtonnet applicateur en bois (écouvillon, tête de coton)	VWR	CA89031-270
Microscope chirurgical Grossissement 5-8X	Scientific	Steromaster
, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Seringues (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Pompe à perfusion pour seringues  ;	Bio-lynx  ;	Thermomètre NE-1000
, -20-110  ; ° ; C	VWR	89095-598
Minuterie	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Racks de tubes (3)	VWR	82024-462
Sonducteur à ultrasons, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tübingen,	coudé Fine Science Tools	15005-08