Il bioconjugation e radiosintesi di⁸⁹ Anticorpi Zr-DFO-etichettati

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

L'eccezionale affinità, specificità e selettività degli anticorpi li rendono vettori straordinariamente interessanti per i radiofarmaci PET tumorali mirati. Grazie alla loro più giorni biologica emivita, anticorpi devono essere etichettati con radionuclidi ad emissione di positroni con decadimento fisico emivita relativamente lunghi. Tradizionalmente, i-positroni emettitori isotopi ¹²⁴ I (t _1/2 = 4.18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 ore), e ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 ore) sono stati utilizzati per etichettare anticorpi per l'imaging PET. Più recentemente, tuttavia, il campo è assistito ad un drammatico aumento dell'uso della ad emissione di positroni radiometalli ⁸⁹ Zr in agenti di imaging PET a base di anticorpi. ⁸⁹ Zr è un radioisotopo quasi ideale per l'imaging PET con immunoconiugati, in quanto possiede un mezzo fisico -Life (t _1/2 = 78,4 ore) che è compatibile con la farmacocinetica in vivo di anticorpi ed emette un relativamente basso enepositroni rgy che produce immagini ad alta risoluzione. Inoltre, gli anticorpi possono essere semplicemente etichettati con ⁸⁹ Zr con il chelante deferoxamina sideroforo-derivato (DFO). In questo protocollo, l'antigene di membrana rivolti anticorpi J591 prostatico specifico sarà utilizzato come sistema modello per illustrare (1) la bioconjugation del chelante bifunzionale DFO-isotiocianato di un anticorpo, (2) la radiosintesi e purificazione di un ⁸⁹ ZR- DFO-mAb radioimmunoconjugate, e (3) in vivo di imaging PET con ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in un modello murino di cancro.

Introduction

A causa della loro notevole sensibilità, affinità e selettività, anticorpi sono stati a lungo considerati vettori promettenti per la fornitura di radioisotopi a cellule tumorali. Tuttavia, la loro applicazione in tomografia a emissione di positroni (PET) è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato radioisotopi ad emissione di positroni per la loro etichettatura. ^1-3 Una delle considerazioni più critici nella progettazione di radioimmunoconjugates è corrispondente al decadimento fisico mezza vita del radioisotopo alla farmacocinetica in vivo dell'anticorpo. Più in particolare, gli anticorpi hanno spesso relativamente lunghi, più giorni di dimezzamento biologico e quindi devono essere etichettati con radioisotopi con emivita fisiche comparabili. Per le applicazioni di imaging PET, gli anticorpi sono stati tradizionalmente radiomarcato con ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 ore), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 ore), o ¹²⁴ I (t _1/2 = 4.18 d). ^{4, 5} Tuttavia, ciascuno diquesti radioisotopi possiede significative limitazioni che ostacolano la loro idoneità per l'imaging clinico. Mentre radioimmunoconjugates etichettati con ⁸⁶ Y e ⁶⁴ Cu sono dimostrati promettenti in studi preclinici, entrambi isotopi possedere emivite fisiche che sono troppo breve per essere efficace per l'imaging nell'uomo. ¹²⁴ I, invece, ha una emivita fisica quasi ideale per l'imaging con anticorpi, ma è costoso e presenta caratteristiche di decadimento subottimali che portano alla risoluzione relativamente bassa immagini cliniche. Inoltre, ¹²⁴ radioimmunoconjugates I marcati possono essere soggetti a dealogenazione in vivo, un processo che può abbassare rapporti attività tumorale-a-background. ^6,7

La spinta a trovare un radioisotopo che emette positroni-a soppiantare ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y, e ¹²⁴ sono in radioimmunoconjugates ha alimentato il recente aumento di ricerche sulla ⁸⁹ anticorpi Zr-etichettati. ^8-12 Tha ragione per l'avvento di ⁸⁹ Zr è semplice: il radiometalli possiede caratteristiche chimico-fisiche quasi ideale e per l'uso in radioimmunoconjugates PET diagnostici ^{13 89} Zr viene prodotto tramite ^l'89 Y (p, n) ⁸⁹ reazione Zr su un ciclotrone con un. commercialmente disponibili e il 100% naturalmente abbondante ⁸⁹ porta Y. ^14,15 Il radiometalli ha un rendimento del 23% di positroni, decade con un'emivita di 78,4 ore, ed emette positroni con relativamente bassa energia di 395,5 keV (Figura 1). ^13,16,17 E 'importante notare che Zr ⁸⁹ emette anche un alta energia, 909 keV γ-ray con efficienza del 99%. Mentre questa emissione non interferisce energicamente con le emessi 511 fotoni keV, richiede considerazione in più per quanto riguarda i trasporti, la gestione, e dosimetria. Nonostante questo avvertimento, queste caratteristiche di decadimento in ultima analisi significa che ⁸⁹ Zr non solo ha un h più favorevolealf-vita per l'imaging con anticorpi di ⁸⁶ Y e ⁶⁴ Cu, ma può anche produrre immagini ad alta risoluzione di ¹²⁴ I, che emette positroni con energie superiori di 687 e 975 keV, nonché un numero di fotoni con energie dentro 100-150 keV di i fotoni positroni creati 511 keV. ¹³ Inoltre, Zr ⁸⁹ è anche più sicuro da maneggiare, meno costosi da produrre, e residualizes nei tumori più efficacemente rispetto al suo omologo iodio radioattivo. ^18,19 Una potenziale limitazione di ⁸⁹ Zr è che non ha un isotopologue terapeutica, ad esempio, ⁸⁶ Y (PET) vs. ⁹⁰ Y (terapia). Ciò preclude la costruzione di chimicamente identici, agenti di imaging surrogati che possono essere impiegati come esploratori dosimetrici per i loro omologhi terapeutici. Detto questo, le indagini indicano che ⁸⁹ anticorpi Zr-marcati hanno potenziale come surrogati di imaging per ⁹⁰ Y e ¹⁷⁷ immunoconiugati Lu-etichettati.^20,21

Dal punto di vista chimico, come un metallo del gruppo IV, ⁸⁹ Zr +4 esiste come cationi in soluzione acquosa. Ion Il Zr ⁴⁺ è altamente caricata, relativamente grande (efficace raggio ionico = 0,84 Å), e può essere classificato come un catione "hard". Come tale, essa presenta una preferenza per ligandi recanti fino a otto dure, donatori di ossigeno anionici. Facilmente il chelante più comune utilizzato in ⁸⁹ radioimmunoconjugates Zr-etichettati è deferoxamina (DFO), un sideroforo-derivato, chelante aciclico recanti tre gruppi idrossammato. Il legante coordina stabilmente il catione Zr ⁴⁺ rapido e pulito a RT a livelli di pH biologicamente rilevanti, e il risultante complesso Zr-DFO rimane stabile nel corso di diversi giorni in soluzione salina, siero di sangue, e sangue intero. ²² studi computazionali suggeriscono fortemente che DFO forma un complesso con hexacoordinate Zr ⁴⁺ in cui il centro metallico è coordinata ai tre neutral e tre donatori di ossigeno anionici del ligando e due leganti acqua esogeni (Figura 2). ^23,24 Il comportamento in vivo della radioimmunoconjugates impiegano la coniugazione scaffold ⁸⁹ Zr-deferoxamina stata generalmente eccellenti. Tuttavia, in alcuni casi, imaging e studi di biodistribuzione acuti hanno rivelato elevati livelli di attività nelle ossa di topi iniettati con ⁸⁹ Zr-anticorpi marcati, dati che suggeriscono che il osteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ catione viene rilasciato dal chelante in vivo e successivamente mineralizza nell'osso. ²⁵ Di recente, una serie di indagini lo sviluppo di nuovi ⁸⁹ Zr ⁴⁺ chelanti ligandi particolare con otto donatori di ossigeno sono apparsi in letteratura. ^24,26,27 Tuttavia, allo stato attuale, DFO è il chelante più ampiamente impiegato in ⁸⁹ radioimmunoconjugates Zr-etichettato con un ampio margine. Una varietà di differentistrategie bioconjugation sono stati impiegati per collegare DFO ad anticorpi, inclusi bioorthogonal click chemistry, la reazione di tiolo reattivo DFO costruisce con cisteine ​​in l'anticorpo, e la reazione dell'estere attivato fruttiferi DFO costruisce con lisine nella anticorpi. ^{4,28- 30} Facilmente la strategia più comune, tuttavia, è stato l'uso di un derivato isotiocianato-cuscinetto di DFO, DFO-NCS (Figura 2). ²² Questo chelante bifunzionale disponibile in commercio robusto e affidabile forma stabile, legami covalenti tiourea con lisine della anticorpo (Figura 3).

Negli ultimi anni, una grande varietà di ⁸⁹ radioimmunoconjugates Zr-DFO-marcati sono stati riportati in letteratura. Indagini preclinici sono stati particolarmente abbondanti, con anticorpi che vanno dal più noto cetuximab, bevacizumab, trastuzumab e di anticorpi più esoteriche come il-CD105 di targeting TRC105 e fPSA-targeting 5A10. ^30-36 Più recentemente, un piccolo numero di studi clinici di fase precoce con ⁸⁹ anticorpi Zr-DFO-marcati sono emerse in letteratura. Trials particolare, i gruppi in Olanda hanno pubblicato impiegano ⁸⁹ Zr-DFO-cmAb U36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomab tiuxetano, e ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 Inoltre, una serie di altri studi clinici con ⁸⁹ radioimmunoconjugates Zr-marcati sono attualmente in corso, comprese le indagini qui al Memorial Sloan Kettering Cancer Center utilizzando la PSMA-targeting ⁸⁹ Zr-DFO-J591 per l'imaging del cancro alla prostata e il ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab-HER2 di targeting per l'imaging del cancro al seno. ^{23, 30} Inoltre, mentre gli anticorpi radioattivi restano i più comuni ⁸⁹ radiofarmaci Zr-etichettati, il radiometalli ha sempre stato impiegato con altri vettori, tra cui peptidi, proteine ​​e nanomateriali. ^38-43 </sup>

La modularità di questo ⁸⁹ Zr-DFO metodologia di etichettatura è una risorsa enorme. Il repertorio di anticorpi-biomarker di targeting è in continua espansione, e l'interesse per l'esecuzione de PET vivo utilizzando questi costrutti sta crescendo rapidamente. Di conseguenza, riteniamo che lo sviluppo di pratiche più standardizzate e protocolli potrebbe beneficiare il campo. Un protocollo sperimentale eccellente scritto per deferoxamina-NCS coniugazione e ⁸⁹ Zr radiomarcatura è già stato pubblicato da Vosjan, et al. ²² Riteniamo che la dimostrazione visiva fornita da questo lavoro potrebbe aiutare ulteriormente gli investigatori nuovi a queste tecniche. Nel protocollo a mano, l'antigene di membrana rivolti anticorpi J591 prostatico specifico sarà utilizzato come sistema modello per illustrare (1) la bioconjugation del chelante bifunzionale DFO-isotiocianato di un anticorpo, (2) la radiosintesi e purificazione del ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate,e (3) in vivo PET con ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in un modello murino di cancro. ^23,44,45

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e alle linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Coniugazione DFO-NCS a J591 In una provetta da microcentrifuga 1,7 ml, preparare una soluzione di 2-5 mg / ml di J591 in 1 ml di soluzione salina 1x tampone fosfato (pH 7,4) o 0,5 M tampone HEPES (pH 7,4). Sciogliere DFO-NCS in DMSO se…

Representative Results

Il primo passo in questo protocollo la coniugazione del DFO-NCS per l'anticorpo è in genere abbastanza robusto e affidabile. Generalmente, purificato, immunoconiugato chelante modificato può essere ottenuta in> 90% di resa, e con 3 equivalenti molari di DFO-NCS nella reazione iniziale coniugazione produrrà un gradi di etichettatura del chelante di circa 1,0-1,5 DFO / mAb. Le 89 Zr radiomarcatura e purificazione fasi della procedura sono altrettanto semplici. Alle concentrazioni indicate nel protocol…

Discussion

Mentre la costruzione, radioimmunoconjugates radiomarcatura, e l'imaging di ⁸⁹ Zr-DFO-etichettati è generalmente una procedura piuttosto semplice, è importante mantenere un paio di considerazioni fondamentali in mente durante ogni fase del processo. Per esempio, forse la causa più probabile di preoccupazione durante la fase coniugazione del procedimento è l'aggregazione dell'anticorpo durante la reazione di coniugazione. Questo problema è spesso un prodotto di scarsa miscelazione della reazio…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide