הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em> במבחנה</em> Assay המרת חלבון הפריון
Summary
Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.
Abstract
Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host’s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host’s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.
Introduction
"ספגות מוח מדבק (TSEs, מחלות פריון) הוא קבוצה של מחלות ניווניות קטלניות עם תקופות דגירה ממושכות המשפיעות על מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם. סוכן etiological המשוער של TSEs מורכב מהאיזומר misfolded של חלבון פריון מארח (PRP), כי הוא מסוגל התפשטות עצמית על ידי המרה מונעת תבנית של הטופס הסלולרי הרגיל של PRP (PRP C) ל, הקשורים למחלות זיהומיות טופס (PRP TSE) המצטבר ברקמות מערכת עצבים מרכזיות של המארח הנגוע 1. פריונים יונקים זיהומיות בדרך כלל להעביר ממארח למארח באופן מינים ספציפיים, דבר שהוביל לרעיון של "מחסום מיני TSE" הגבלת אירועי שידור interspecies 2. הגורמים הביולוגיים של מחסום מיני פריון אינם מובנה היטב. דמיון רצף חומצות האמיניות בין PRP TSE זיהומיות והמארח ג PRP Cמאוד משפיע אם הגיור מתקיים 3-5, אבל נשאר מספיק כדי להסביר את כל אירועי שידור הפריון נצפו in vivo 6,7.
לפיכך, אפיון חסמי מיני TSE הסתמך במידה רבה על מחקרים בבעלי החיים אתגר: חשיפת בעלי חיים תמימים ממין נתון לפריונים מאחרים ומדידת זמן דגירה וכתוצאה מכך להתפרצות מחלה ושיעור התקפת כאינדיקטורים של יעילות העברת. עכברים להביע PRP C ממיני Heterologous משמשים גם לסוג זה של מחקר 8. העלויות כרוכות בייצור מהונדס עכבר וbioassays פריון הממושך, כמו גם שיקולים אתיים של שימוש בבעלי חיים, הם מכשולים בדרך לחקירה ניסויית של מחסומי מיני TSE. הערכה של מכשול המין האנושי לTSEs מסתמכת על עכברים שהונדסו אדם PRP C. עכברים אלה דורשים תקופות דגירה ארוכות להיכנע לTSEs או שינויים כדי לא אנושייםהוא מולקולת PRP C בבני אדם למחלה מהירה תחילת 9. תקופות דגירה לTSEs לא אנושי בעכברים אלה עשויות להאריך את תוחלת החיים מעבר לעכבר הרגיל עושה פרשנות של תוצאות שליליות מאתגרות. פרימטים שאינם בני אדם יש גם שימשו כשליחים ללימוד מחסומי מין אנושיים, אך מחקרים אלה הם טומנים בחובה אותם האתגרים כמו סוגים אחרים של ניסויים בבעלי חיים וקופים שאינם בני אדם עשוי שלא בדיוק לשחזר מחלה כפי שהוא ממשיך במארח האנושי.
bioassays בעלי החיים יישאר בשיטה "תקן זהב" למדידת הרגישות של מינים לTSE, אבל המכשולים, העלויות והאתיקה של מחקרים בבעלי החיים חיים אלה אילצו את חקירת חלופות. מספר מבחני במבחנה, המבוססים על הערכת ההמרה של מארח PRP C לproteinase K (PK) מדינת -resistant (מיל PRP) כאשר שנזרעו על ידי PRP TSE, פותחו ושימוש כדי לחקור sp TSEמחסומי ecies 10-12. דוגמאות למבחנים במבחנה כוללות מבחני תא ללא המרה, חלבון misfolding הגברה מחזורית (PMCA), ויחס יעילות המרת assay (CER) 10-14. למרות שאף אחד ממבחנים אלה לקחת בחשבון גורמים היקפיים המעורבים במחסומי מינים לאחר הדבקה טבעית, כולם יכולים להיות שימושיים כדי לזהות מארחים פוטנציאליים רגישים לTSEs.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור assay CER, שבו שני מצעי PRP C מפוגלים נגזרים מhomogenates המוח הנורמלית משמשים בתגובות המרת פריון העליונה ספסל (איור 1) 13. PRP C במצע המפוגל ב- pH 7.4 ניתן להמיר רק למיל PRP ידי PRP TSE זורעים לתוך התגובה בהיעדר מחסום מינים 14. בניגוד לכך, denaturation של PRP C במצע האחר ב- pH 3.5 מאפשר לה להיות מומר לדגירה הבאה מיל PRPעם PRP TSE מכל מינים ומשמש כביקורת לגיור. יחס ההמרה של PRP C למיל PRP בpH 7.4 ביחס מצע לזה של מצע 3.5 pH מספק מדד של מחסום המינים. מצאנו כי assay CER מנבא ידוע מחסומי מינים של עכברי מעבדה לTSEs השונים והשתמש assay במאמצים כדי לחזות את מחסום המינים של מינים רבים של יונקים, כוללים איל בר, למחלה כרונית לבזבז (CWD) וTSEs האחר 14, 15. חוקרים מעוניינים בכלי המאפשר סינון מהיר של מחסומים או הערכה של המרת PRP C מיל -כדי-PRP מיני TSE ימצא מתודולוגיה זו שימושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיום מוצלח של פרוטוקול זה, יש לשים לב לרמות PRP C ברקמות מוח נגוע משמשות להכנת מצע (שלב 2.1.2) והזרע למצע יחס לתגובות המרה (שלב 4.4.2). מניסיוננו, ניתן לחלץ את המוח לשימוש כמצע CER לאחר נתיחה שלאחר מות תקופה משמעותית, כל עוד PRP C נמצא על ידי immunoblotting (איור 4). למ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O’Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemica; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. . Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
- Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
- Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
- Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
- Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).
- Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32 (2008).
- Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
- Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
- Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
- Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
- Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
- Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
- Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
- Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
- Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
- Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
- Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).
- Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
- Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).
- Russell, W. M., Burch, R. I. . The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).
