Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
Les cellules cancéreuses réagissent à la matrice de rigidité mécanique d'une manière complexe en utilisant un hiérarchique système coordonné mécano-chimique composée de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires 1, 2. mécanosensibilité de cellules cancéreuses différentes in vitro sont étudiée principalement avec des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires. Par conséquent, on en sait peu sur la mécanosensibilité de cellules de cancer du côlon humains primaires in vitro. Ici, un protocole optimisé est développé qui décrit l'isolement de cellules du colon à partir d'échantillons humains primaires saines et cancéreuses tissus humains chirurgicales. Les cellules du côlon isolés sont ensuite cultivés avec succès sur le doux (2 kPa raideur) et rigide (10 kPa raideur) hydrogels de polyacrylamide et polystyrène rigide (~ 3,6 GPa de rigidité) substrats fonctionnalisés par une matrice extracellulaire (fibronectinedans ce cas). Les microbilles fluorescentes sont incorporées dans des gels mous à proximité de la surface de culture cellulaire, et essai de traction est effectué pour évaluer les contraintes de contraction cellulaire en utilisant le logiciel d'accès ouvert libre. En outre, la microscopie d'immunofluorescence sur des substrats différents de rigidité fournit des informations utiles sur la morphologie de la cellule primaire, l'organisation du cytosquelette et la vinculine contenant adhésions focales en fonction de la rigidité substrat.
Introduction
Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus évident que les micro-environnement mécanique, en plus des facteurs biochimiques, joue un rôle important dans la régulation des fonctions cellulaires. Les cellules peuvent détecter et de répondre à la rigidité du substrat sur lequel elles sont respectées (comme dans la culture 2D) ou entourées par (comme dans la culture 3D) 7.3. En faisant cela, les cellules peuvent moduler leur différenciation 3, 4 morphologie, la migration / mobilité 5, biophysiques propriétés 6, 7 croissance, et d'autres processus.
Les cellules cancéreuses répondent également à la rigidité de la matrice 2D et 3D en utilisant une combinaison coordonnée hiérarchique mécano-chimique de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires 1, 2. Par exemple, les cellules epitheliales mammaires (CEM) former parenchyme acineuses normale lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats 150 Pa qui est similaire à la rigiditédes tissus mammaires sains. Fait intéressant, ils présentent les caractéristiques d'une tumeur en développement, à la fois structurelles et de transcription, lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats rigides (> 5000 Pa) qui imitent la rigidité d'un stroma tumoral 8. En outre, une autre expérience montre que la tumorigenèse mammaire est accompagné par une réticulation du collagène et de raidissement 9 ECM. Des expériences récentes montrent que carcinome du côlon humain HCT-8 () cellules présentent des métastases phénotype (MLP) lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats 2D ayant la rigidité physiologiquement pertinente (20-47 kPa), mais pas sur très raide (3,6 GPa) substrats 10- 12 .Ces premières cellules forment des amas de cellules tumorales comme dissocient et puis de l'autre, à partir de la périphérie. Comme cette épithéliale à arrondie morphologique (E à R transition) changement se produit, elles prolifèrent, réduire cellule-cellule et cellule-ECM adhérence, et devenir migratoire. HCT-8 cellules cultivées sur des substrats de polystyrène très durs ne pas exposer ceux-citraits malignes. Ainsi, il a été émis l'hypothèse que HCT-8 cellules deviennent métastatique en raison de leur exposition aux micro-environnement approprié. Il est à noter que ces expériences sont réalisées avec des lignées cellulaires de cancer immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires.
Une étude récente propose que le stress augmentée de traction cellulaire peut être utilisé comme une signature biophysique potentiel pour les cellules métastatiques 13 .Le étude consiste à mesurer la force de traction de différentes lignées de cellules cancéreuses humaines sur des gels de Polyacrylamide. On constate que les cellules cancéreuses métastatiques peuvent exercer une contrainte sensiblement plus élevé de traction par rapport aux cellules non métastatiques 13 dans tous les cas. Cependant, ces résultats contredisent directement les résultats publiés précédemment sur murins lignées cellulaires dérivées du cancer du sein 14. En outre, une étude récente met en évidence des différences notables entre les cellules humaines immortalisées et primaires dans leur remodelage du cytosquelette proprofilage protéine et la survie cellulaire expression de la protéine 15. Par conséquent, il est important de revenir sur la plupart des tests biophysiques traction, y compris pour les cellules cancéreuses humaines primaires. Cela permettra de répondre à la question de savoir si les cellules primaires récapitulent immortalisée lignées cellulaires de cancer tendance de traction.
Le protocole décrit ici est optimisée pour l'isolement de cellules primaires humaines du côlon (à la fois saines et cancéreuses), et pour les cultiver sur des substrats mous (hydrogels de Polyacrylamide), ainsi que sur des boîtes de Pétri. Le protocole est basé sur la digestion enzymatique et dissociation consécutive de l'échantillon de tissu chirurgical en suspension de cellules individuelles 16. A notre connaissance, ceci est la première démonstration de la culture isolée tumeur primaire du colon et de cellules normales directement sur des substrats souples d'hydrogel avec microbilles fluorescentes embarqués pour la traction cytométrie. Substrats de gel transparent permettent également immunocoloration. Cette analyse a révélé des différences dans l'organisation F-actine etadhésions focales dans les cellules du côlon humaines primaires que les changements de rigidité du substrat. Cette plate-forme de culture cellulaire ouvre la possibilité d'explorer diverses propriétés biophysiques des cellules humaines primaires telles que la rigidité des cellules et de traction en tant que paramètres de pronostic du cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effort de traction cellulaire a récemment émergé comme un indicateur potentiel biophysique de l'état métastatique 13. Cependant, aucune donnée expérimentale de traction avec des cellules tumorales primaires existe dans la littérature à ce jour. En outre, la culture directement isolées les cellules du côlon primaire sur différents gels rigidité de polyacrylamide est pas encore signalé. Par conséquent, nous établissons un système optimisé côlon primaire conditions de culture cellulaire su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
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