Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Summary

Un protocole est décrit pour extraire des cellules humaines primaires de la tumeur du côlon chirurgical et des tissus normaux. Les cellules isolées sont ensuite cultivées sur des substrats élastiques souples (hydrogels de polyacrylamide) fonctionnalisés par une protéine de matrice extracellulaire, et noyées dans des microbilles fluorescentes. La cytométrie de traction est réalisée pour évaluer les stress contractiles cellulaires.

Abstract

Les cellules cancéreuses réagissent à la matrice de rigidité mécanique d'une manière complexe en utilisant un hiérarchique système coordonné mécano-chimique composée de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires ^{1, 2.} mécanosensibilité de cellules cancéreuses différentes in vitro sont étudiée principalement avec des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires. Par conséquent, on en sait peu sur la mécanosensibilité de cellules de cancer du côlon humains primaires in vitro. Ici, un protocole optimisé est développé qui décrit l'isolement de cellules du colon à partir d'échantillons humains primaires saines et cancéreuses tissus humains chirurgicales. Les cellules du côlon isolés sont ensuite cultivés avec succès sur le doux (2 kPa raideur) et rigide (10 kPa raideur) hydrogels de polyacrylamide et polystyrène rigide (~ 3,6 GPa de rigidité) substrats fonctionnalisés par une matrice extracellulaire (fibronectinedans ce cas). Les microbilles fluorescentes sont incorporées dans des gels mous à proximité de la surface de culture cellulaire, et essai de traction est effectué pour évaluer les contraintes de contraction cellulaire en utilisant le logiciel d'accès ouvert libre. En outre, la microscopie d'immunofluorescence sur des substrats différents de rigidité fournit des informations utiles sur la morphologie de la cellule primaire, l'organisation du cytosquelette et la vinculine contenant adhésions focales en fonction de la rigidité substrat.

Introduction

Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus évident que les micro-environnement mécanique, en plus des facteurs biochimiques, joue un rôle important dans la régulation des fonctions cellulaires. Les cellules peuvent détecter et de répondre à la rigidité du substrat sur ​​lequel elles sont respectées (comme dans la culture 2D) ou entourées par (comme dans la culture 3D) ^7.3. En faisant cela, les cellules peuvent moduler leur différenciation ^{3, 4} morphologie, la migration / mobilité ^5, biophysiques propriétés ^{6, 7} croissance, et d'autres processus.

Les cellules cancéreuses rép....

Protocol

Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices de l'UIUC comité d'éthique de la recherche humaine.

1. Collecte et digestion de l'échantillon de tissu chirurgical

1. Recueillir l'échantillon de tissu tumoral juste après la résection du côlon (figure 1A et 1B). Prélever des tissus sur un site sain adjacent ainsi.
2. Transférer le tissu immédiatement dans un flacon de 15 ml contenant 12 ml de solution HBSS. Conserver le flacon sur la glace à l'intérieur d'une boîte de mousse isolante.
3. Transporter le tissu contenant flacon à une culture capot de tissu pour un traitement....

Results

Le protocole décrit ci-dessus est utilisé avec succès pour plusieurs échantillons de tissus (n = 12) de quatre patients différents selon les lignes directrices de la commission d'examen institutionnel. Figure 1A illustre une tumeur colorectale représentant tout de suite après la chirurgie à partir de laquelle on obtient des coupes de tissus pour les cultures de cellules. Une section typique de tissu dans une solution HBSS après le transfert de la hotte laminaire pour un traitement supplémentaire est rep.......

Discussion

Effort de traction cellulaire a récemment émergé comme un indicateur potentiel biophysique de l'état métastatique ^13. Cependant, aucune donnée expérimentale de traction avec des cellules tumorales primaires existe dans la littérature à ce jour. En outre, la culture directement isolées les cellules du côlon primaire sur différents gels rigidité de polyacrylamide est pas encore signalé. Par conséquent, nous établissons un système optimisé côlon primaire conditions de culture cellulaire sur des gels et polys.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
HBSS	Life technologies	14175-095
PBS	Lonza	17-516F
Trypsine	Worthington	LS003736
Collagenese	Worthington	LS004176
3- Aminopropyltryméthoxysilane (ATS)  ;	Sigma-Aldrich	281778
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	01201-5
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
N-méthylènebisacrylamide (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
Solution tampon HEPES	Sigma-Aldrich	83264
Persulfate d’ammonium	Bio-Rad	161-0700
Fibronectine humaine	BD biosciences	354008
Hydrate d’hydrazine	Sigma-Aldrich	18412
Acide acétique	Sigma-Aldrich	A6283
Paraformaldéhyde  ;	Microscopie électronique Sciences	RT15710
Amplificateur de signal	technologies	I36933
Anticorps monoclonal anti-vinculine  ;	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG	Life technologies	A11001
TRITC conjugués à la phalloïdine  ;	Sigma-Aldrich	P1951
0.1 et micro ; m billes fluroscentes	Life technologies	F8801
0,25 % Trypsine-EDTA	Life technologies	25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips	Corning	2865-12