Chromatin नियामकों और अमेरिका में जीनोम चौड़ा स्नैपशॉट<em> Xenopus</emचिप Seq द्वारा> भ्रूण

Summary

कैसे क्रोमेटिन नियामकों और chromatin राज्यों का सवाल विवो में जीनोम सेल भाग्य का निर्णय विकासशील भ्रूण में बना रहे हैं कि कैसे जल्दी की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है प्रभावित करते हैं। चिप Seq-एक वैश्विक स्तर है Xenopus भ्रूण के लिए यहाँ उल्लिखित पर क्रोमेटिन सुविधाओं की जांच के लिए सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोण।

Abstract

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Introduction

The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly^1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency³. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes⁴. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)⁵. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes.

Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species—X. tropicalis and X. laevis—have now been released by the International Xenopus Genome Consortium⁶. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.

The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.^7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.

Protocol

नोट: सभी Xenopus काम ब्रिटेन पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) मेडिकल रिसर्च के लिए एमआरसी राष्ट्रीय संस्थान द्वारा कार्यान्वित रूप अधिनियम 1986 के साथ पूरी तरह अनुरूप है। 1. तैयारी चिप प्रयोग (चर्चा देखें) के लिए आवश्यक भ्रूण की संख्या का अनुमान है। निम्नलिखित आरटी पर जमा हो जाती है, जो समाधान तैयार: 7.5 करने के लिए समायोजित और autoclaving द्वारा निष्फल EDTA, पीएच बिना 10x मार्क संशोधित Ringers (एमएमआर) के 500 मिलीलीटर (1 एम NaCl, 20 मिमी KCl, 20 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी MgSO 4, 50 मिमी HEPES पीएच 7.5) 10, 1 1% एसडीएस) और एक 5x डीएनए लोड हो रहा है बफर (0.2% ऑरेंज जी, 30% ग्लिसरॉल के मिलीलीटर, 60 एसडीएस क्षालन बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, मिलीलीटर मिमी EDTA 8.0 पीएच)। 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है, जो निम्न समाधानों को तैयार: 50 एचईजी बफर (50 मिमी HEPES-KOH के पीएच 7.5, 1 मिमी EDTA पीएच 8.0, 20% ग्लिसरॉल), निष्कर्षण बफ़र्स E1 (50 मिमी HEPES-KOH के पीएच की 500 मिलीलीटर की मिलीलीटर 7.5, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी प्रवर्तन निदेशालयटीए। 10% ग्लिसरॉल, 0.5% Igepal सीए-630, 0.25% ट्राइटन X-100), E2 (10 मिमी 8.0 पीएच Tris-एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.5 मिमी EGTA), और E3 (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% Igepal सीए-630, 0.25% ना-deoxycholate, 0.1% एसडीएस), RIPA बफर (50 मिमी HEPES-KOH के पीएच 7.5, 500 मिमी LiCl, 1 मिमी EDTA के 500 मिलीलीटर , 1% Igepal सीए-630, 0.7% ना-deoxycholate) और दस बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl) के 50 मिलीलीटर। स्कोर और 7 एमएल निशान पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार polystyrene ट्यूब क्लिप। Sonication के दौर से गुजर परमाणु अर्क शामिल करने के लिए इस ट्यूब का प्रयोग करें। पोस्ट-अनुक्रमण विश्लेषण के लिए, कम से कम 8 जीबी रैम और 500 जीबी मुक्त डिस्क स्थान के साथ एक मल्टीकोर यूनिक्स शैली ऑपरेटिंग कंप्यूटर का उपयोग करें। स्थानीय स्तर पर जो की सबसे कमांड लाइन पर इस्तेमाल कर रहे हैं निम्नलिखित सॉफ्टवेयर स्थापित करें: FastQC, Illumina casava-1.8 गुणवत्ता फिल्टर, bowtie 11, SAMtools 12, होमर 13, MACS2 14, IGV 15,16, Cluster3 17, जावा TreeView, विस्फोट + 18, और b2g4pipe <sup> 19। Compilers और तीसरे पक्ष के सॉफ्टवेयर के लिए स्थापना निर्देशों और आवश्यकताओं की जाँच करें। कम NGS Xenopus जीनोम को पढ़ता aligning के लिए एक Bowtie सूचकांक बनाएँ। एक उदाहरण एक्स के लिए यहाँ दिखाया गया है Xenbase FTP सर्वर (/ पब / जीनोमिक्स / JGI) से एक FASTA फ़ाइल (genome.fa) के रूप में डाउनलोड किया जा सकता है, जो tropicalis जीनोम V7.1 (2011 नवंबर),। Bowtie के सूचकांक उपनिर्देशिका को FASTA फ़ाइल ले जाएँ। XenTro7 सूचकांक फाइल उत्पन्न करने के लिए (> शीघ्र चरित्र के बाद यहाँ) निम्न आदेश पंक्ति का उपयोग करें: > Bowtie निर्माण /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7 > निर्यात BOWTIE_INDEXES = / रास्ता / के लिए / bowtie / सूचकांक / UCSC जीनोम ब्राउज़र या उपकरण / टेबल ब्राउज़र के माध्यम से नवीनतम जीनोम संस्करणों (genomes.nimr.mrc.ac.uk) के लिए NIMR सर्वर पर दर्पण साइट से जीन एनोटेशन फ़ाइल (GTF) को डाउनलोड करें। जीनोम FASTA फ़ाइल और एच अनुकूलित करने के लिए GTF फ़ाइल का उपयोग करेंXenopus के लिए ओमेर (जैसे, एक्स tropicalis जीनोम V7.1, – xenTro7 नाम)। वैकल्पिक रूप से, Xenopus जीनोम के कुछ पुराने संस्करण के लिए पूर्व निर्मित HOMER संकुल का उपयोग करें। > LoadGenome.pl -name xenTro7 -org अशक्त -fasta /path/to/genome.fa -gtf रास्ता / के लिए / genes.gtf और एनोटेशन फ़ाइल (genes.gtf) (एक ही फ़ोल्डर में genome.fa.fai फाइल के साथ genome.fa) एक अनुक्रमित FASTA फ़ाइल अपलोड करके जीनोम ब्राउज़र IGV के लिए एक जीनोम ट्रैक (.genome फाइल) बनाएँ। इस प्रकार के रूप Xenopus जीनोम के लिए एक जीनोम पाड़ सूचकांक (genome.fa.fai) बनाएँ: > Samtools faidx /path/to/genome.fa इस प्रकार के रूप Xenopus जीनों पर कई मॉडल प्रजातियों (मानव, माउस, zebrafish, फल मक्खी और खमीर) से जीन सत्तामीमांसा (जाएँ) शर्तें पारित करने के लिए बम विस्फोट + उपयोग: उपकरण के माध्यम से UCSC जीनोम ब्राउज़र से एक भी FASTA फ़ाइल (cds.fa) के रूप में सभी कोडिंग दृश्यों (सीडीएस) डाउनलोड/ टेबल ब्राउज़र और गैर बेमानी प्रोटीन (एनआर) की पूर्व स्वरूपित ब्लास्ट डेटाबेस के साथ अद्यतन ब्लास्ट +: > Update_blastdb.pl एन.आर. मानव (txid9606) के लिए खोज, माउस (txid10090), zebrafish (txid7955), फल मक्खी (txid7227) और खमीर (txid4932) इसकी उन्नत खोज समारोह के माध्यम से एन सी बी आई की साइट से प्रोटीन (http: //www.ncbi.nlm.nih। शासन / प्रोटीन / उन्नत) और कंप्यूटर के लिए परिणामी सैनिक (अनुक्रम पहचानकर्ता) सूची (sequence.gi.txt) भेज सकते हैं। एक निश्चित उम्मीद (ई) मूल्य कटौती (यहाँ 10 -20) के साथ BLASTx निष्पादित द्वारा सैनिक सूची में से ज्यादातर इसी तरह प्रोटीन के लिए Xenopus जीन निरुपित। सुनिश्चित करें कि आउटपुट स्वरूप XML है बनाओ (-outfmt 5 -out blastx_results.xml)। उपलब्ध कंप्यूटर कोर की संख्या के साथ सहसंबंधी जो समय की बचत धागे (-num_threads) का उपयोग करें। > Blastx -db / रास्ता / के लिए / NR -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / रास्ता / टीहे / cds.fa -evalue 1E-20 -outfmt 5 -out /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# धागे] एक पाठ संपादक के साथ b2g4pipe फ़ोल्डर की b2gPipe.properties फ़ाइल को खोलने और Dbacces.dbname = b2go_sep13 और Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com करने के लिए डेटाबेस के गुण का अद्यतन करें। स्थापना फ़ोल्डर से भागो b2g4pipe। > जावा Xmx1000m -cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe अलावे /path/to/blastx_results.xml -out परिणाम / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot नोट: इस कार्यक्रम के अर्क मारा प्रत्येक विस्फोट के लिए शर्तें जाना है और इसी Xenopus जीन (xenTro7.annot) करने के लिए उन्हें प्रदान करती है। सबसे अद्यतन डेटाबेस सेटिंग्स उपकरण के तहत पाया जा सकता है / जनरल सेटिंग्स / Blast2GO जावा वेब शुरू आवेदन की DataAccess सेटिंग्स (9.11.1 देखें)। 2. Chromatin पार से जोड़ने Xenopus अंडे, डे-जेली और संस्कृति उन्हें खादbryos मानक प्रोटोकॉल 20 के अनुसार। टोपी के साथ एक 8 एमएल कांच नमूना शीशी के हित के विकास के चरण में dejellied भ्रूण (अधिकतम 2500 एक्स laevis या 10,000 एक्स tropicalis) स्थानांतरण और 0.01x एमएमआर के साथ संक्षिप्त उन्हें एक बार धो लें। आरटी पर 40 मिनट के लिए 15 के लिए (जैसे, 8 मिलीलीटर 0.01x एमएमआर को 36.5-38% formaldehyde के 225 μl जोड़ें) 0.01x एमएमआर में 1% formaldehyde के साथ भ्रूण फिक्स (निर्धारण समय और आवश्यक भ्रूण की संख्या के लिए चर्चा देखें ) चिप प्रयोग के प्रति। नोट: Formaldehyde संक्षारक और अत्यधिक विषैला होता है। यह आंख और त्वचा से संपर्क करें, अपच, और साँस लेना के मामले में खतरनाक है। शीशी formaldehyde जोड़ने जब धूआं हुड का प्रयोग करें। संक्षेप में ठंड 0.01x एमएमआर के साथ भ्रूण तीन बार धोने से निर्धारण करना बंद करो। सतह तनाव उन्हें टूटना का कारण बनता है क्योंकि Embry ओएस तरल सतह के साथ संपर्क बनाने के लिए मत देना। बर्फ पर 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में भ्रूण विभाज्यलगभग 250 μl (एक्स tropicalis) या अंडे सेने से पहले 600 μl (एक्स laevis) की मात्रा पर कब्जा है, जो ट्यूब प्रति 250 भ्रूण की एक अधिकतम के साथ। संभव के रूप में पिपेट दूर के रूप में ज्यादा 0.01x एमएमआर। आप धारा 3 के साथ तुरंत जारी रखते हैं तो निम्न चरण छोड़ दें। ठंड एचईजी बफर के 250 μl में भ्रूण संतुलित करना। भ्रूण ट्यूब के नीचे करने के लिए तय हो चुका है एक बार जितना संभव हो उतना तरल निकालने और तस्वीर फ्रीज तरल नाइट्रोजन में। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 3. Chromatin निकालना नोट: Xenopus भ्रूण से पार से जुड़े chromatin की निम्नलिखित निकासी 2.3 कदम और 50-80 एक्स में संकेत दिया निर्धारण समय के साथ सबसे अधिक कुशलता से काम करता है 40 एक्स के लिए tropicalis या 25 निष्कर्षण बफर E1, E2 और E3 के प्रति मिलीलीटर भ्रूण laevis। बफर के दो बार गणना की मात्रा की आवश्यकता है ताकि प्रत्येक निकासी कदम है, दोहराया है। बढ़ाने के लिए, कई 2 मिलीलीटर microcentri उपयोगFuge ट्यूब या 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब। क्रोमेटिन निकासी के दौरान बर्फ पर नमूने और buffers रखें। बफ़र्स E1, E2 और 1 मिमी डीटीटी के साथ E3 और protease अवरोध करनेवाला गोलियों की पर्याप्त संस्करणों अनुपूरक। एक phospho विशिष्ट एंटीबॉडी, 5 मिमी NAF और 2 मिमी ना 3 वीओ 4 के साथ आगे पूरक बफ़र्स के साथ चिप प्रदर्शन कर रहे हैं। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा E1 के साथ तय भ्रूण homogenize। 2 मिनट के लिए 1000 XG पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में अपकेंद्रित्र homogenates (या 5 मिनट 50 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करने के मामले में)। सतह पर तैरनेवाला और दीवार से जुड़ी किसी भी लिपिड aspirate। E1 में छर्रों Resuspend। 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रखें। 3.2 कदम के रूप में अपकेंद्रित्र और त्यागने supernatants। E2 में छर्रों Resuspend। 3.2 कदम के रूप में अपकेंद्रित्र और त्यागने supernatants। दोहराएँ कदम 3.4, लेकिन centrifugation के पहले 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रहते हैं। E3 में छर्रों Resuspend। कम से कम 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रखें। अपकेंद्रित्र और त्यागने सु3.2 कदम के रूप में pernatants। नोट: इस स्तर पर, resuspensions काफी पारदर्शी बन जाना चाहिए। E3 में ऋणयानी डिटर्जेंट घुलनशील शेष जर्दी प्लेटलेट्स की सबसे प्रतिपादन द्वारा पार से जुड़े नाभिक निकाल सकते हैं। पार से जुड़े नाभिक Resuspend और पूल छर्रों E3 के 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा में (सामान्य रूप से insolubilized वर्णक कणिकाओं से भूरा रंग)। यह बहुत चिपचिपा प्रकट होता है और पिपेट के लिए मुश्किल है अगर दो या तीन मिलीलीटर E3 के साथ नमूना पतला। बर्फ पर रखें या 4 डिग्री सेल्सियस पर ही या अगले दिन पर कदम 4 के साथ आगे बढ़ने के लिए। बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में स्नैप-फ्रीज। 4. Chromatin विखंडन नोट: Sonication solubilize करने और पार से जुड़े क्रोमेटिन कतरनी दोनों का इस्तेमाल किया जाता है। यहाँ एक 1/16 इंच पतला microtip और ध्वनि बाड़े से लैस Misonix sonicator 3000 को चलाने के लिए मानकों हैं। अन्य sonicators का उपयोग अगर, 'निर्माताओं की सिफारिशों कतरनी का पालन करेंपार से जुड़े क्रोमेटिन या कुल में 4-8 मिनट के लिए 12 डब्ल्यू करने के लिए 6 का उपयोग करें। Sonication के (1.4 कदम) के लिए एक कस्टम निर्मित ट्यूब में कदम 3.7 से परमाणु नमूना स्थानांतरण। एक छोटी थर्मामीटर क्लैंप के माध्यम से बर्फ के पानी से भर एक 800 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर से जुड़ी ट्यूब होने से sonication के दौरान ठंडा नमूना रखें। एक प्रयोगशाला जैक पर बीकर रखें। Sonicator microtip ट्यूब दीवार को छूने के बिना मात्रा गहराई के बारे में दो तिहाई के लिए नमूने में पानी में डुबोया और केंद्रित है, इसलिए है कि जैक को समायोजित करें। कुल में सात मिनट के लिए नमूना Sonicate, 1 मिनट pauses के साथ हर 30 सेकंड बाधित। 1.0 करने के लिए शक्ति निर्धारित करें। Sonication के आरंभ और तुरंत नमूना झाग शुरू होता है अगर डब्ल्यू तुरंत रोकें 9 से 12 का एक पढ़ने तक पहुँचने के लिए (आमतौर पर 2 से 4) बिजली की सेटिंग वृद्धि हुई है। ट्यूब का स्थान बदलें और झाग पूरी तरह से गायब हो गया है जब पुनः आरंभ करें। 15,0> (पूरी रफ्तार से पूर्व ठंडा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और स्पिन में sheared क्रोमेटिन स्थानांतरण4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 00 XG)। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पूर्व ठंडा सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। क्रोमेटिन विखंडन (धारा 5) की डिग्री कल्पना करने के लिए (आदर्श चारों ओर 400.000 या अधिक नाभिक क्रोमेटिन युक्त) सतह पर तैरनेवाला के 50 μl ले लीजिए। चिप (धारा 6) के लिए सतह पर तैरनेवाला के बाकी का उपयोग करें। अप करने के लिए एक दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने हैं। Aliquots के रूप में स्नैप-फ्रीज नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में (चिप प्रयोग के प्रति एक)। 5. इमेजिंग Chromatin विखंडन एसडीएस क्षालन बफर के 50 μl, 5 एम NaCl के 4 μl और कदम 4.6 से सतह पर तैरनेवाला के 50 μl के लिए proteinase कश्मीर (20 माइक्रोग्राम प्रति / μl) की एक μl जोड़ें। ओवन 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक संकरण में 6 से 15 घंटा (ओ / एन) के लिए सेते हैं। एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग डीएनए शुद्ध। यदि आवश्यक हो, निर्माता से सिफारिश के रूप में पीएच को समायोजित करने के लिए सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) के 3 एम का उपयोग करें। Eluteडीएनए दो बार क्षालन बफर के 11 μl (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.5) के साथ। एक 100 बीपी के साथ-साथ पूरे नमूना और वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 1.4% agarose जेल पर एक एक केबी डीएनए सीढ़ी चलाने से पहले RNase एक के 0.4 μl (20 माइक्रोग्राम प्रति / μl) और 5x डीएनए लोड हो रहा है बफर के 5 μl जोड़ें। वैद्युतकणसंचलन के बाद एक सुरक्षित न्यूक्लिक एसिड धुंधला समाधान के साथ इष्टतम परिणाम, दाग जेल के लिए। 6. chromatin immunoprecipitation नोट: इस खंड में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए चुंबकीय मोती धोने के लिए कम प्रतिधारण 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और ट्यूब प्रति संकेत बफर के कम से कम 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। मोतियों से बफर हटाने से पहले, 20 हर बार सेक करने के लिए 30 या समाधान स्पष्ट है जब तक के लिए चुंबकीय रैक में ट्यूब छोड़ दें। एक नया ट्यूब कदम 4.6 से सतह पर तैरनेवाला (sheared क्रोमेटिन) के 30 μl स्थानांतरण करने के लिए 10 चिप के लिए इस्तेमाल कुल chromatin के लगभग 1% से मेल खाती है जो इनपुट नमूना, के रूप में बाद में इस्तेमाल किया जाएगा। 4 पर स्टोरचिप नमूने पार लिंक को पलटने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक सी °। एक नया ट्यूब शेष क्रोमेटिन स्थानांतरण। एक एंटीबॉडी नियंत्रण की आवश्यकता होती है चिप qPCR के प्रयोगों के लिए, दो ट्यूबों के लिए chromatin की बराबर मात्रा वितरित। क्रोमेटिन करने के लिए चिप ग्रेड एंटीबॉडी (या इसी एंटीबॉडी नियंत्रण) जोड़ें। एक मोटा गाइड के रूप में, के बारे में एक माइक्रोग्राम प्रति रुचि का मिलान व्यक्त एक लाख कोशिकाओं प्रति एंटीबॉडी का उपयोग करें। अधिक सही एंटीबॉडी के विभिन्न मात्रा के साथ ही चिप चलाने के लिए, (उदाहरण के लिए, 0.25 माइक्रोग्राम प्रति, एक माइक्रोग्राम प्रति और 2.5 माइक्रोग्राम प्रति) चिप प्रयोग के प्रति आवश्यक एंटीबॉडी की राशि का अनुमान और चिप qPCR के द्वारा नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण loci में उपज की तुलना करने के लिए (देखें धारा 10)। एक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में, एंटीबॉडी के रूप में एक ही निर्धारण और मेजबान जानवरों की प्रजातियों के सामान्य सीरम का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर / एक रोटेटर (10 आरपीएम) हे पर एन सेते हैं। 5 मिनट के लिए एक E3 के साथ एक बार एंटीबॉडी-संगत चुंबकीय मोतियों की एक पर्याप्त राशि धोएंटी 4 डिग्री सेल्सियस। चेक मोतियों की एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता के लिए निर्माता की विशिष्टता (मोतियों की आमतौर पर 5 से 20 μl आईजीजी एंटीबॉडी के एक माइक्रोग्राम प्रति बाँध)। एंटीबॉडी पूर्व incubated क्रोमेटिन धोया मोती जोड़ें। इसके अलावा चार घंटे के लिए एक रोटेटर (10 आरपीएम) पर सेते हैं। धो पूर्व ठंडा दस बफर के साथ एक बार फिर चार बार (चिप qPCR) या पूर्व ठंडा RIPA बफर के साथ दस बार (चिप Seq), और मोती। एक चिप Seq प्रयोग का प्रदर्शन अगर केवल इस कदम से बाहर ले। Resuspend ट्यूब प्रति दस बफर के 50 μl में मोतियों धोया। एक नया ट्यूब के लिए उन्हें स्थानांतरित द्वारा एक एकल चिप प्रयोग से पूल सभी मोती। ट्यूब के नीचे मोती एकत्र करने के लिए 1,000 XG पर चुंबकीय रैक और प्रशीतित (4 डिग्री सेल्सियस) centrifugation का प्रयोग करें। मोतियों की गोली बाधा पहुँचा के बिना के रूप में ज्यादा तरल रूप में संभव त्यागें। एसडीएस क्षालन बफर और vort की 50 से 100 μl में मोतियों resuspending द्वारा मोती बंद पट्टी चिप सामग्री65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक thermomixer (1000 आरपीएम) के साथ लगातार उन्हें exing। 30 सेकंड के लिए पूरी गति (> 15,000 XG) पर कि सेंट्रीफ्यूज के बाद। एक नया ट्यूब सतह पर तैरनेवाला (चिप eluate) स्थानांतरण। पिछले चरण को दोहराएँ और चिप eluates गठबंधन। 7. Chromatin रिवर्स पार से जोड़ने और डीएनए शुद्धि 100 से 200 μl (कदम 6.10) है जो चिप नमूना, की मात्रा तक पहुँचने के लिए इनपुट नमूना (कदम 6.1) के लिए पर्याप्त एसडीएस क्षालन बफर जोड़ें। 5 एम NaCl के 1/20 की मात्रा के साथ दोनों चिप और इनपुट के नमूने अनुपूरक। एक संकरण ओवन में 65 डिग्री सेल्सियस पर 6 से 15 घंटा (ओ / एन) के लिए नमूने सेते हैं। 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल ते बफर और RNase ए की एक मात्रा में जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल proteinase कश्मीर जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे से 4 के लिए सेते हैं। फिनोल से डीएनए शुद्ध: क्लोरोफॉर्म: इथेनॉल वर्षा द्वारा पीछा isoamyl शराब निकासी पहले से 9 उल्लिखित के रूप में। चिप Seq के लिए, 32 को जोड़नेक्षालन बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.5) की μl डीएनए गोली भंग करने के लिए। 30 मिनट के डीएनए पूरी तरह से भंग कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए बर्फ पर नमूने छोड़ दें। नोट: वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट कम डीएनए वसूली है, लेकिन और अधिक सुविधाजनक हैं, और चिप-qPCR के नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चिप Seq के लिए, fluorometry आधारित विधियों का उपयोग कर चिप और इनपुट डीएनए के एक μl की एकाग्रता का निर्धारण। निर्माता के निर्देशों का पालन करें और डीएनए की एकाग्रता fluorometer के विश्वसनीय पता लगाने रेंज के भीतर गिर जाता है सुनिश्चित करें। 8. चिप Seq पुस्तकालय निर्माण और विधिमान्यकरण नोट: डीएनए पुस्तकालय तैयारी के लिए वर्तमान तरीकों 1 से 2 एनजी को NGS के लिए उच्च जटिलता पुस्तकालयों के निर्माण की अनुमति है। कुछ जटिलता की कीमत पर, पुस्तकालयों डीएनए के रूप में छोटा रूप में 50 पीजी (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) से बनाया जा सकता है। चिप और इनपुट पुस्तकालय दोनों के लिए डीएनए का एक ही राशि का उपयोग करें। संक्षेप में, पहुंचई अनुक्रमित चिप Seq पुस्तकालयों, चिप और इनपुट डीएनए अंत मरम्मत की जरूरत है (बनती अंत), (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) विशेष एडाप्टर के लिए ligated, आकार-चयनित और पीसीआर प्रवर्धित। चिप Seq पुस्तकालयों बनाने के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन करें। आगे की सिफारिशों के लिए चर्चा देखें। क्षालन बफर के 12 μl में प्रत्येक पुस्तकालय elute और एक fluorometer का उपयोग प्रत्येक चिप और इनपुट पुस्तकालय की एक μl की एकाग्रता का निर्धारण। 5 से 25 एनजी / μl की सांद्रता की अपेक्षा करें। सांद्रता अधिक से अधिक 25 एनजी / μl हैं अगर पीसीआर चक्र (कम से कम 18 चक्रों) की संख्या को कम करने पर विचार करें। नोट: सटीक मात्रा का ठहराव इष्टतम NGS परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। 18 पीसीआर चक्र के बाद एक एनजी / μl के रूप में के रूप में कम सांद्रता के साथ पुस्तकालय अनुक्रम, लेकिन अक्सर कम जटिलता की जा सकती है। टुकड़ा आकार के वितरण निर्धारित करने के लिए पुस्तकालय की एक μl का प्रयोग करें और सी के द्वारा किसी भी एडाप्टर डिमर संदूषण (बैंड के चारों ओर 120 बीपी) के लिए जाँच करने के लिएहिप-आधारित केशिका वैद्युतकणसंचलन। 1: 1 के एक मोती-से-नमूना अनुपात के साथ ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण शुद्धि दोहराएँ (के बजाय 1.6: 1) पुस्तकालय एडाप्टर dimers शामिल हैं। इसी तरह के डीएनए संवर्धन के रुझान से पहले और पुस्तकालय तैयारी के बाद मनाया जाता है कि क्या जांच करने के लिए मान्य सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण लोकी (धारा 10 देखें) पर qPCR प्रदर्शन करना। अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता नियंत्रण अनुमोदित पुस्तकालयों को जमा करें। 9. पोस्ट-अनुक्रमण विश्लेषण और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन नोट: आजकल, NGS अक्सर घर में या वाणिज्यिक अनुक्रमण सुविधाएं (कुछ NGS दिशा निर्देशों के लिए चर्चा देखें) द्वारा किया जाता है। मानक आउटपुट अनुक्रमण पढ़ता के लाखों लोगों के भंडारण एकल या एकाधिक gzip के संकुचित FASTQ फ़ाइलें (* .fastq.gz) कर रहे हैं। आम तौर पर, मल्टिप्लेक्स उनके सूचकांक के अनुसार पहले से ही अलग हो रहे हैं पढ़ता है और प्रत्येक पढ़ें प्रत्येक बस के लिए एक दृश्य पहचानकर्ता और एक गुणवत्ता नियंत्रण स्कोर (Illumina के लिए Phred + 33 1.8+) शामिलई कॉल। यह दृष्टिकोण यहाँ NGS डेटा का विश्लेषण करने के लिए कैसे कई मायनों में से केवल एक है। पाठक निम्न कमांड लाइनों में से किसी को इस क्षेत्र में तेजी से आगे बढ़ रहा है और अद्यतन नियमित रूप से उत्पन्न कर रहे हैं के रूप में परिवर्तन की आवश्यकता है कि क्या जांच करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। Gzip के संकुचित FASTQ फ़ाइलों को जुटना और FastQC स्क्रिप्ट का उपयोग अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता की जांच। इस पर अमल और दोनों चिप और इनपुट अनुक्रमण डेटा के लिए निम्न आदेश के सबसे टर्मिनल से (उदाहरण चिप के लिए दिखाया गया है): > बिल्ली /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz > Fastqc ChIP.fastq.gz नोट: एक उच्च जटिलता चिप Seq पुस्तकालय के सफल अनुक्रमण से कच्चे डेटा अधिकांश परीक्षण पारित करना चाहिए। विफलताओं गरीब अनुक्रमण रन और ऐसे पक्षपाती पीसीआर प्रवर्धन या अनुकूलक संदूषण के रूप में प्रयोगात्मक कलाकृतियों से मुख्य रूप से उत्पन्न। निरर्थक सदाशयी डीएनए संवर्धन का प्रतिनिधित्व कर सकते पढ़ता के रूप में दोहराव (अतिरेक) की एक निश्चित डिग्री की उम्मीद है <suपी> 21। 5 'अंत या पढ़ता है – – हालांकि, एक बाद में पढ़ने के टैग को सीमित कर सकते करने के लिए एक आधार जोड़ी प्रति किसी भी निरर्थक (कदम 9.4) 21 चोटियों का पता लगाने संवेदनशीलता को प्रभावित किए बिना पढ़ता खत्म करने के लिए। पूर्व प्रक्रिया अनुक्रमण डेटा (homerTools ट्रिम -3 <एडाप्टर अनुक्रम>) की अनुमति के एक बेमेल (-mis 1) एडाप्टर संदूषण दूर करने के लिए। बंधाव पर ब्याज की डीएनए टुकड़ा करने के लिए समीपस्थ ('3' 5) (अनुक्रमित) एडाप्टर के पहले 20 ठिकानों का उपयोग करें (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका में सूचीबद्ध एडाप्टर के लिए दिखाया गया है)। > Gzip सीडी ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vN> ChIP.fastq > HomerTools ट्रिम -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT एक -min 36 ChIP.fastq -mis नोट: फ़िल्टर्ड के हटाने (एन) केवल Illumina 1.8 द्वारा उत्पन्न FASTQ फाइलों में मूलभूत रूप से आवश्यक है पढ़ता है। Fastq_illumina_filter आदेश न आना (यानी,। '| Fastq_illumina_filter -vN')1.8 की तुलना में एक पुराने संस्करण अनुक्रम पहचानकर्ता उत्पन्न करते हैं। संरेखित पूर्व प्रसंस्कृत Bowtie का उपयोग करते हुए संदर्भ जीनोम (xenTro7) को पढ़ता है। केवल विशिष्ट मैप किए आते पढ़ता (-m 1) (एस) के पहले 28 कुर्सियां ​​और सैम प्रारूप में अधिक से अधिक 70. रिपोर्ट संरेखण के पढ़ने के अनुसार सभी बेमेल की कुल Phred + 33 गुणवत्ता स्कोर में डिफ़ॉल्ट यानी सेटिंग्स, अधिक से अधिक दो बेमेल जोड़ी का उपयोग कर । हिस्सा स्मृति समाप्त हो रहा है अगर धागा प्रति मेगाबाइट (–chunkmbs) की संख्या में वृद्धि: > Bowtie -m एक एस -p [# धागे] –chunkmbs [जैसे 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam नोट: Bowtie डिफ़ॉल्ट रूप से Phred + 33 गुणवत्ता स्कोर की उम्मीद है। विकल्प शामिल हैं – phred64-quals FASTQ फ़ाइल 1.8 से अधिक उम्र के Illumina द्वारा Phred + 64 गुणवत्ता स्कोर के साथ उत्पन्न किया गया है। एक अहम शख्स फ़ाइल (.bw) में संरेखण (एसएएम) फाइल को बदलने के लिए दो HOMER आदेशों का उपयोग करें: > MakeTagDirectory चिप / एकल -tbp एक ChIP.sam > MakeUCSCfile चिप /ChIP.bw -o -bigWig / रास्ता / के लिए / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1e7 नोट: परिवर्तन संदर्भ जीनोम (कदम 1.8) के पाड़ सूचकांक (genome.fa.fai) की आवश्यकता है। यहाँ प्रोफ़ाइल (-norm 1e7) 10 मिलियन करने के लिए आधार जोड़ी (-tbp 1) और सामान्यीकृत प्रति एक टैग को पढ़ता सीमित है। अहम शख्स गतिशील रूप से इस तरह के IGV (कदम 9.12) के रूप में एक जीनोम ब्राउज़र के साथ क्रोमेटिन प्रोफाइल को कल्पना करने के लिए पसंदीदा प्रारूप में से एक है। (जैसे, +/- 25 बीपी डिब्बे, के साथ 10 केबी -si ज़ी 20,000 -hist 25) ऐसे प्रतिलेखन प्रारंभ (टीएसएस, उदाहरण के यहां दिखाया गया है) और समाप्ति के रूप में (जीनोमिक स्थलों पर टैग की वितरण (घ चिप /) का निर्धारण टीटीएस) साइटों। Xenopus एनोटेशन xenTro7 (कदम 1.7) के साथ HOMER पर्ल स्क्रिप्ट annotatePeaks.pl चलाएँ: > AnnotatePeaks.pl टीएसएस xenTro7 उत्पत्ति का आकार 20,000 -hist 25 -d चिप /> ChIP_tagDensity.tss चिप के बीच डीएनए संवर्धन की महत्वपूर्ण चोटियों का पता लगाएं(ChIP.sam आयकर) और एक्स में इनपुट (ग Input.sam) tropicalis जीनोम मॉडल के निर्माण के लिए 200 बीपी (–bw = 200) के एक (0.01 -q) 1% एफडीआर कटऑफ और (sonication के बाद) डीएनए टुकड़े के साथ MACS2 इस्तेमाल करते हैं। ऐसे हिस्टोन के निशान या शाही सेना पोलीमरेज़ रूप में ब्याज की क्रोमेटिन सुविधा का एक व्यापक वितरण की उम्मीद अगर इस कमांड लाइन के लिए झंडा –broad जोड़ें। > Macs2 callpeak आयकर ChIP.sam -c Input.sam च एसएएम -n चिप जी 1.4376e9 -q 0.01 –bw = 200 नोट: एक्स के प्रभावी आकार tropicalis जीनोम विधानसभा V7.1 के बारे में 1437600000 बीपी (जी 1.4376e9) है। MACS2 उनके जीनोमिक स्थानों के साथ चोटियों enlisting एक बिस्तर फ़ाइल (ChIP_peaks.bed) उत्पन्न करता है। एक क्लस्टर हीटमैप के रूप में कई क्रोमेटिन प्रोफाइलों की तुलना करें: ब्याज की टैग घनत्व निर्देशिकाओं से एक टैग वितरण मैट्रिक्स बनाने (घ चिप / other_ChIP /) MACS2 चोटियों (कम उदाहरण के लिए, 25 बीपी डिब्बे, उत्पत्ति का आकार 2000 -hist 2 के साथ +/- 1 केबी5 -ghist): > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 उत्पत्ति का आकार 2000 -hist 25 -ghist -d चिप / other_ChIP /> ChIP.matrix ChIP.matrix फाइल को अपलोड करने और पदानुक्रम निकटतम केन्द्रक के लिए कम से कम इयूक्लिडियन दूरी के आधार पर इन टैग घनत्व क्लस्टर Cluster3 के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का प्रयोग करें। क्लस्टरिंग कल्पना करने के लिए जावा TreeView में उत्पन्न सीटीडी फ़ाइल खोलें। शिखर शिखर पर समृद्ध कर रहे हैं, जो उपन्यास और पहले से ज्ञात बाध्यकारी रूपांकनों, +/- 100 बीपी (200 उत्पत्ति का आकार) का पता लगाएं। आकृति घटनाओं नक्शा करने के लिए और आकृति घनत्व साजिश करने के लिए annotatePeaks.pl का उपयोग करें: > FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / उत्पत्ति का आकार 200 -p [# धागे] > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1 > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif उत्पत्ति का आकार 800 -hist 25> motif1.density नोट: findMotifsGenome.pl स्क्रिप्ट infeरुपये तुलना से संवर्धन बेतरतीब ढंग से जीन केंद्रित पृष्ठभूमि दृश्यों चयनित करने के लिए। सबसे समृद्ध उपन्यास आकृति वजन की स्थिति मैट्रिक्स के प्रारूप में motif1.motif के तहत बचाया है। पाठक ऐसे cisFinder 22 और MEME के रूप में 23 अन्य डी नोवो आकृति खोज के तरीकों के साथ इन परिणामों को पुष्ट करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। निकटतम जीन को उनकी दूरी की गणना के द्वारा और 400 बीपी खिड़कियां (400 उत्पत्ति का आकार) के भीतर अपने सामान्यीकृत पढ़ें गणना का निर्धारण करके चोटियों पर टिप्पणी: > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 400 घ चिप / इनपुट /> ChIP_peaks.genes उत्पत्ति का आकार संख्या (एन), स्थान और व्यक्ति (आर) की सामान्यीकृत पढ़ें गिनती और निकटतम (लक्ष्य) जीन प्रति सभी (एलआर) चोटियों की सूची के लिए निम्नलिखित ऑक कमांड के प्रयोग से उत्पादन संक्षेप। > ऑक '{ टी' $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000 एफएस =} शुरू ' {एन [$ 8] + = 1; आर [$ 8] + = $ 9; एलआर [$ 8], 'एलआर [$ 8] = &# 39; $ 7 '(' $ 9 '')} अंत {के लिए (मैं एन में) {प्रिंट मैं 'टी' एन [मैं] '' t आर [मैं] '' t substr (एलआर [मैं], 2)}} 'ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary नोट: $ के बाद संख्या पिछले चरण में बनाया ChIP_peaks.genes फ़ाइल फिट करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है, जो स्तंभ संख्या को संदर्भित करता है। यह स्क्रिप्ट कापी 5 KB नदी के ऊपर और टीएसएस के बहाव 1 केबी परे चोटियों बाहर फिल्टर। $ 7, $ 8 और 9 $ टीएसएस, क्रमशः जीन पहचानकर्ता और चोटी के प्रति सामान्यीकृत पढ़ें गणना, के लिए दूरी के लिए देखें। के रूप में निम्नानुसार लक्ष्य जीन के बीच समृद्ध जाने की दृष्टि से विश्लेषण करते हैं: जावा वेब प्रारंभ (javaws) 19 के माध्यम से कमांड लाइन से Blast2GO के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस शुरू करो। > Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp एनोटेशन अपलोड करने के लिए डेवलपर्स 'निर्देशों का पालन करेंXenopus 1.9.4 में उत्पन्न के रूप में जीन (xenTro7.annot) और पहचान लक्ष्य जीन के एक फ्लैट फ़ाइल के लिए फ़ाइल। एक ही जीन पहचानकर्ता दोनों फाइलों में इस्तेमाल कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। पटरियों के रूप में IGV में अहम शख्स (ChIP.bw, Input.bw) और बिस्तर फ़ाइलें (ChIP_peaks.bed) जोड़कर क्रोमेटिन प्रोफाइल को कल्पना। आरएनए seq साथ पूरक डेटा विकास का एक ही स्तर के लिए अगर उपलब्ध पटरियों। एक सत्र के रूप में परिणाम को बचाओ। प्रोग्रामिंग प्लेटफार्मों उपयोग आर (www.r-project.org) से ऊपर उत्पन्न के रूप में आगे आंकड़ों में हेरफेर और कल्पना करने के लिए या Matlab। वैकल्पिक रूप से, एक्सेल के साथ छोटे डेटासेट साजिश है। 10 चिप qPCR के परीक्षण चिप के लिए और अनुरुप चिप Seq सकारात्मक (पीक विशिष्ट) और नकारात्मक नियंत्रण लोकी दोनों के लिए 60 डिग्री सेल्सियस (टी एम) में लगभग 100 बीपी डीएनए आसपास के प्राइमरों डिजाइन करने के लिए ऑन लाइन मंच Primer3 का प्रयोग करें। प्राइमर विशिष्टता का उपयोग करते हुए इस बात की पुष्टि में सिलिको </उन्हें> पीसीआर खोज UCSC जीनोम ब्राउज़र में लागू किया है। लगभग 1% इनपुट से शुरू तीन गुना dilutions की एक 8 सूत्री मानक वक्र बनाने या दो का उपयोग करें – डीएनए संवर्धन की मात्रा का ठहराव के लिए ΔΔC (टी) विधि 8,24। अगर जरूरत हो, मानक वक्र नमूने सभी नमूनों, यानी, चिप, नियंत्रण के लिए तकनीकी triplicates में वास्तविक समय पीसीआर निष्पादित और। इनपुट डीएनए के प्रतिशत के रूप में या सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण लोकी दोनों पर नियंत्रण नमूना बनाम चिप की एक अनुपात के रूप में प्लॉट डीएनए संवर्धन।

Representative Results

प्रोटोकॉल में अच्छी तरह से मार डाला है अगर यहाँ प्रस्तुत उन के बराबर परिणाम की उम्मीद कर रहे हैं और उपयोग में एंटीबॉडी चिप ग्रेड गुणवत्ता (चर्चा देखें) की है। इस प्रोटोकॉल formaldehyde के तय Xenopus भ्रूण से नाभिक की निकासी और sonication द्वारा chromatin की कुशल कर्तन (चित्रा 1 ए सी) की अनुमति देता है। Sheared क्रोमेटिन मुख्य रूप से 100 से 1000 बीपी को लेकर और बीपी (चित्रा 1C) 300 के बीच और 500 बढ़ता जा डीएनए टुकड़े की एक असममित वितरण से पता चलता है। Immunoprecipitated डीएनए के एक न्यूनतम 50 पीजी सफलतापूर्वक इसी आकार डीएनए सम्मिलित करता है (2A चित्रा) के साथ एक अनुक्रमित बनती अंत चिप Seq पुस्तकालय बनाने के लिए आवश्यक है। पुस्तकालय में लगभग 120 बीपी electropherogram पर देखा जा सकता है जो एडाप्टर dimers, की काफी हद तक विहीन होना चाहिए। अनुक्रमण-दर-संश्लेषण पर, पढ़ता पूर्व प्रसंस्कृत जीनोम (चित्रा 2B, सी) के लिए मैप किया जाता है। एक सफल प्रयोग के साथ में <eएम> एक्स। tropicalis भ्रूण, एकल अंत की सामान्य रूप से 50 से 70% ज़्यादा से ज़्यादा दो बेमेल साथ V7.1 के जीनोम विधानसभा के लिए विशिष्ट मैप किया जा सकता है 40 बीपी की पढ़ता है। इनपुट जीनोम भर में काफी समान रूप से संरेखित पढ़ता है, जबकि चिप के संरेखण ब्याज की क्रोमेटिन सुविधा पार्श्व कि कतरा-विशिष्ट संवर्धन में परिणाम पढ़ता है। सभी टुकड़ों 5 'अंत (चित्रा -2) 25 से अनुक्रम कर रहे हैं क्योंकि यह है। एक औसत टुकड़ा आकार करने के लिए दिशा पढ़ने में संरेखण विस्तार ऐसे प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी घटनाओं के रूप में एकल क्रोमेटिन सुविधाओं के लिए सही प्रोफाइल को पैदा करता है। IGV या किसी भी अन्य संगत जीनोम ब्राउज़र में कल्पना जब ये डीएनए ऑक्यूपेंसी चोटियों के रूप में दिखाई देते हैं। एमएसीएस की तरह पीक कॉल करने के लिए इन चोटियों (चित्रा 3 ए) का स्थान निर्धारित करने के लिए किया जाता है। दसियों बाध्यकारी साइटों के हजारों की इस तरह एक्स में निर्धारित किया गया है tropicalis जीनोम ऐसी VegT 26 के रूप में टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक के लिए। चिप qPCR के अनुभवबयान चिप Seq (3B चित्रा) द्वारा पाया स्थानीय संवर्धन की पुष्टि करनी चाहिए। चिप Seq प्रयोगों क्रोमेटिन सुविधाओं का जीनोम चौड़ा विशेषताओं की खोज की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, इस तरह के प्रतिलेखन आरंभ और समाप्ति साइटों के रूप में जीनोमिक तत्वों पर पढ़ें वितरण की गणना के जीनों के आसपास किसी भी स्थानिक बंधन वरीयताओं (चित्रा -3 सी) को उजागर कर सकते हैं। इसी तरह, शिखर स्थानों पर पढ़ने के वितरण की एक हीटमैप एक जीनोम व्यापक पैमाने (चित्रा 3 डी) पर विभिन्न क्रोमेटिन सुविधाओं की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कुछ प्रतिलेखन कारक संभावित सह कारकों (3E चित्रा) के सह-समृद्ध रूपांकनों सहित इस तरह की जानकारी प्राप्त कर सकते हैं जीनोमिक डीएनए अंतर्निहित चोटियों के डीएनए अनुक्रम-विशेष रूप से। डी नोवो आकृति विश्लेषण बाँध। लक्ष्य जीन के महान बहुमत डीएनए एक कम से कम अधिभोग के बजाय उच्च स्तर (चित्रा 3F) दिखा। इस पैमाने से मुक्त सुविधा टीआर के बीच काफी आम हो रहा हैanscription कारकों और लक्ष्य जीन की केवल एक छोटा सा अंश सीधे जैविक प्रासंगिकता 27,28 साथ विनियमित रहे हैं कि पता चलता है। इस तरह आगे Xenopus भ्रूण (चित्रा 3 जी) में क्रोमेटिन सुविधा के जैविक समारोह में अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकता है लक्ष्य जीन का अंतर अभिव्यक्ति के रूप में समृद्ध जाने की दृष्टि से या अन्य विशेषताओं का विश्लेषण। Xenopus भ्रूण के लिए 1. chromatin immunoprecipitation प्रक्रिया चित्रा। (ए) के भ्रूण formaldehyde के तय covalently बाँध (पार से लिंक) के लिए ब्याज जीनोमिक डीएनए के साथ जुड़े किसी भी प्रोटीन के विकास के चरण में हैं। परमाणु निष्कर्षण (बी) पर, पार से जुड़े क्रोमेटिन बाध्यकारी जीनोमिक डीएनए या flanking डी.एन. कम करके क्रोमेटिन संशोधन साइटों नीचे संकीर्ण करने के लिए खंडितएक दृश्य (सी)। इसके बाद, क्रोमेटिन टुकड़े ब्याज (डी) का मिलान उन युक्त समृद्ध करने के लिए एक चिप ग्रेड एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated कर रहे हैं। सह-immunoprecipitated डीएनए प्रोटीन से छीन लिया और NGS (चित्रा 2) के लिए चिप टुकड़ा पुस्तकालय बनाने से पहले (ई) शुद्ध होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2. चिप Seq पुस्तकालय तैयारी, अनुक्रमण-दर-संश्लेषण, मानचित्रण और शिखर बुला रही है। (ए) electropherogram 250 बीपी 450 के डीएनए टेम्पलेट्स के साथ एक अच्छा चिप-Seq पुस्तकालय प्रदर्शित करता है। इन खाकों यूनिवर्सल (58 बीपी) द्वारा flanked ब्याज की डीएनए डालने और अनुक्रमित (63 बीपी) एडाप्टर करना पड़ेगा। (बी) </समान> लाखों, प्रतिवर्ती, अलग फ्लोरोफोरे और समान समाप्ति गुण रखने के लिए सभी चार न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति में आधार से अनुक्रम के आधार हैं। फ्लोरोसेंट छवियों पढ़ता में अंततः इकट्ठा कर रहे हैं जो इसी कुर्सियां, कॉल करने के लिए वास्तविक समय में कार्रवाई कर रहे हैं। (सी) केवल विशिष्ट Xenopus जीनोम के लिए नक्शा रखा जाता है कि पढ़ता है। सभी टुकड़ों 5 'अंत से अनुक्रम कर रहे हैं, चिप के मानचित्रण ब्याज की क्रोमेटिन सुविधा पार्श्व कि कतरा-विशिष्ट चोटियों में परिणाम पढ़ता है। इस प्रकार, शिखर कॉलर्स सही रूप क्रोमेटिन सुविधाओं स्थानीयकरण करने के लिए एक औसत टुकड़ा लंबाई को पढ़ता immunoprecipitation से निकलती है और विस्तार है कि संवर्धन का पता लगाने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img aलेफ्टिनेंट = "चित्रा 3" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 52,535 / 52535fig3highres.jpg" /> चित्रा 3. युग्मज टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक VegT (zVegT)। सभी यहाँ दिखाया मायने रखता है 10 लाख के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं पढ़ने के विशिष्ट मैप और गैर बेमानी पढ़ता है। (ए) के अंश के माध्यम से पोस्ट-अनुक्रमण विश्लेषण और डेटा दृश्य का एक उदाहरण zVegT के जीनोम चौड़ा प्रोफाइल एक्स में बाध्यकारी की (Nieuwkoop और फैबर 29 के बाद 12.5 चरण 11) tropicalis गेसट्रुला भ्रूण। प्रत्येक चोटी, बढ़ाया पढ़ता के एक ढेर-अप, एक बाध्यकारी साइट का प्रतिनिधित्व करता है। इन चोटियों 1% से कम की एक झूठी खोज की दर (एफडीआर) के साथ MACS2 द्वारा कहा जाता है। प्रत्येक mesp जीन बाध्यकारी बहुत समीपस्थ और अपस्ट्रीम zVegT पता चलता है, लेकिन केवल MESPA और mespb कि मंच (आरएनए Seq डेटा 30) द्वारा व्यक्त कर रहे हैं। (बी) zVegT के डीएनए अधिभोग के स्तर को कई loci में चिप qPCR के द्वारा निर्धारित रूप में (एक गैर सहित केबी अपस्ट्रीम β -actin की -bound क्षेत्र 0.5) आत्मविश्वासचिप Seq द्वारा पाया विशिष्ट संवर्धन RM। (ए) में (लाल पट्टी) नामक चोटी के साथ MESPA के लिए परिणामों की तुलना करें। डीएनए अधिभोग स्तर दोनों के लिए निवेश का एक प्रतिशत है, VegT एंटीबॉडी (आईजीजी निर्धारण का खरगोश पॉलीक्लोनल) और एंटीबॉडी नियंत्रण (सामान्य खरगोश आईजीजी) के साथ चिप के साथ चिप के रूप में कल्पना की है। त्रुटि सलाखों दो जैविक प्रतिकृति का मानक विचलन को दर्शाते हैं। (सी) Metagene विश्लेषण के आसपास किसी भी अन्य जीनोमिक क्षेत्र के लिए और जीन शरीर के भीतर प्रमोटर रिश्तेदार के लिए बाध्य तरजीही zVegT (टैग 25 बीपी से अधिक binned) से पता चलता है। (डी) हीटमैप कश्मीर मतलब पता चलता है क्लस्टर (कश्मीर = 5) डीएनए अधिभोग के स्तर गेसट्रुला चरण में सभी zVegT बाध्य क्षेत्रों के लिए zVegT और Smad2 / Smad3 (चिप Seq डेटा 31) के सापेक्ष (टैग 25 बीपी से अधिक binned)। हीटमैप डी नोवो आकृति विश्लेषण zVegT- के 38% में आकृति बाध्यकारी विहित टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक पता चलता है दो आधारित है और बीपी प्रति 5 टैग पर केन्द्रित। (ई) लॉग इन करेंअंतर्निहित आकृति स्कोर पृष्ठभूमि दृश्यों में 5% की खोज की दर के लिए सामान्यीकृत है अगर बाध्य क्षेत्रों के। विहित Smad2 / Smad3 बाध्यकारी आकृति शायद ही समृद्ध है, जबकि घनत्व का नक्शा, zVegT बाध्यकारी साइटों के केंद्र में टी बॉक्स मूल भाव के लिए उच्चतम संवर्धन से पता चलता है। (एफ) हिस्टोग्राम प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए गणना कर रहे हैं जो zVegT के डीएनए अधिभोग के स्तर से पता चलता है [-] सभी चोटियों (+/- 200 बीपी) 5 KB अपस्ट्रीम के बीच से। प्रतिलेखन शुरू होने से साइटों इसी की और 1 केबी नीचे की ओर [+] (जी) उच्चतम डीएनए अधिभोग के भीतर -5 केबी का स्तर और एक केबी कर रहे हैं के साथ शीर्ष 300 जीनों जल्दी भ्रूण के विकास की जैविक प्रक्रियाओं के लिए समृद्ध। ये शर्तें zVegT के ख्यात समारोह के साथ लाइन में हैं जाओ। एफडीआर एक दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण पर आधारित है और कई परीक्षण के लिए सही है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हमारी प्रोटोकॉल बनाने के लिए और Xenopus भ्रूण से जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए रूपरेखा कैसे। यह सिलिको में समृद्ध जीनोमिक साइटों का प्रतिनिधित्व पढ़ता के लाखों लोगों के प्रसंस्करण के लिए vivo में अंतर्जात स्थल को पार से जोड़ने प्रोटीन से हर कदम को शामिल किया गया। जीनोम ड्राफ्ट की बढ़ती संख्या में उपलब्ध हैं के बाद से, इस प्रोटोकॉल अन्य मॉडल और गैर-मॉडल जीवों के लिए लागू किया जाना चाहिए। पिछले काम ^8,31,33,34 से अलग इस प्रोटोकॉल सेट जो सबसे महत्वपूर्ण प्रायोगिक खंड, पार से जुड़े नाभिक को निकालने के लिए पोस्ट-निर्धारण प्रक्रिया है। यह कुशल क्रोमेटिन solubilisation और बाल काटना और आसान बढ़ाने की सुविधा। साथ में पुस्तकालय की तैयारी के सुधार क्षमता के साथ इस प्रोटोकॉल आधे से ब्याज की क्रोमेटिन जुड़े मिलान व्यक्त दो लाख कोशिकाओं को उच्च जटिलता चिप Seq पुस्तकालयों के निर्माण की अनुमति देता है। चिप qPCR के प्रयोगों के लिए, इन कोशिकाओं के कुछ दस हजार सामान्य रूप से पर्याप्त हैंशायद छह अलग जीनोमिक loci में डीएनए संवर्धन के लिए जाँच करने के लिए। ये संख्या रूढ़िवादी अनुमान कर रहे हैं, लेकिन, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर, एंटीबॉडी गुणवत्ता के आधार पर दक्षता, और मिलान एक्सेसिबिलिटी पार से जोड़ने भिन्न हो सकते हैं। एक गाइड के रूप में, एकल Xenopus भ्रूण मध्य ब्लासटुला चरण (Nieuwkoop और फैबर ²⁹ के बाद 8.5) पर 4000 के बारे में सेल शामिल हैं, देर से गेसट्रुला चरण (12) पर 40,000 कोशिकाओं और जल्दी tailbud चरण (20) से कम 100,000 कोशिकाओं।

कुशल immunoprecipitation के लिए सटीक निर्धारण समय चिप qPCR (धारा 10) द्वारा अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रयोग एक्स शामिल है अगर सामान्य में, अब निर्धारण बार आवश्यक हैं भ्रूण, जल्दी विकास के चरणों, और कमजोर (या अप्रत्यक्ष रूप से) डीएनए बाध्यकारी गुण laevis। हालांकि, यह क्रोमेटिन बाल काटना कम कुशल हो जाता है, के रूप में 40 मिनट से अधिक समय Xenopus भ्रूण फिक्सिंग, या संकेत दिया (धारा 3) की तुलना में अधिक भ्रूण प्रसंस्करण की सिफारिश नहीं है। यह महत्वपूर्ण है कि नहींबहुत मुश्किल जर्दी युक्त भ्रूण से परमाणु निकासी कर सकते हैं formaldehyde के शमन के लिए यह आम कदम के रूप में निर्धारण के बाद किसी भी ग्लाइसिन उपयोग करने के लिए। वर्तमान में, इस का कारण ज्ञात नहीं है। यह formaldehyde-ग्लाइसिन अभिवर्तन आगे अमीनो-समूहों या arginine अवशेषों ³⁵ एन टर्मिनल के साथ प्रतिक्रिया करता है कि बोधगम्य है।

एंटीबॉडी किसी भी चिप प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है और पर्याप्त नियंत्रण (Landt एट अल। ³⁶ से दिशानिर्देश देखें) ब्याज की मिलान के लिए अपनी विशिष्टता दिखाने के लिए बाहर ले जाने की जरूरत है। कोई चिप ग्रेड एंटीबॉडी उपलब्ध है, तो इन प्रोटीनों पर कब्जा endogeneous बाध्यकारी साइटों ³⁷ सकते हैं, मिलान टैग संलयन प्रोटीन इसी की शुरूआत एक वैध विकल्प हो सकता है। इस मामले में, uninjected भ्रूण एक नकारात्मक नियंत्रण के बजाय गैर विशिष्ट सीरम के साथ एक चिप के रूप में उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं। ब्याज की प्रोटीन enri के गरीब वसूली में जिसके परिणामस्वरूप कम स्तर पर व्यक्त की है, तो यह रणनीति भी लागू किया जा सकता हैCHEd डीएनए।

क्योंकि प्रयोग में डीएनए की कम राशि की चिप Seq पुस्तकालयों, बनाने के लिए के रूप में, यह सफाई चरणों की संख्या को कम करने और कम से कम डीएनए के किसी भी हानि रखने के लिए प्रतिक्रियाओं गठबंधन करने के लिए है कि प्रक्रियाओं के लिए चुनते करने की सिफारिश की है। एडेप्टर और प्राइमरों (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण और NGS मंच के साथ संगत होना करने की जरूरत है। (लंबी एकल असहाय हथियार युक्त) वाई-एडेप्टर का उपयोग करते हैं, यह आकार का चयन डीएनए आवेषण पहले पीसीआर के तीन से पांच दौर के साथ पूर्व बढ़ाना पुस्तकालय के लिए महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए।, 100 बी पी 300 के लिए) जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा। एकल असहाय सिरों डीएनए टुकड़े विभिन्नतापूर्वक विस्थापित करने के लिए कारण। ट्रायल पीसीआर चक्र की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं इनपुट डीएनए (उदाहरण के लिए, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 और 20 एनजी) के विभिन्न मात्रा के साथ चलाता है (कम से कम या 18 चक्र के बराबर) एक आकार बनाने के लिए आवश्यक 100 से 200 एनजी के -selected पुस्तकालय। पीसीआर चक्रों की संख्या को कम करना redu का अनुक्रमण rendersndant कम होने की संभावना पढ़ता है। ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण मोती कुशलता से ब्याज के डीएनए की वसूली और मज़बूती से बंधाव और पीसीआर प्रतिक्रियाओं से किसी भी मुफ्त एडेप्टर और dimers दूर करने के लिए अभिकर्मकों की सफाई अच्छे हैं।

संख्या, प्रकार और लंबाई के मामले में चारों ओर 20 से 30 मिलियन एकल अंत 36 बीपी पर्याप्त गहराई के साथ पूरे Xenopus जीनोम को कवर करने के लिए सबसे चिप-Seq प्रयोगों के लिए पर्याप्त है की पढ़ता है, पढ़ता की। सबसे अधिक प्रचलित NGS मशीनों इन मानदंडों को पूरा करने में नियमित रूप से सक्षम हैं। हालांकि, इसे पढ़ता है की एक व्यापक वितरण की उम्मीद है अगर पढ़ता के बजाय तेज चोटियों से, हिस्टोन संशोधनों के साथ मनाया के रूप में, संख्या को बढ़ाने के लिए फायदेमंद हो सकता है। कई चिप Seq प्रयोगों के लिए, 4-5 अलग ढंग से सूचीबद्ध पुस्तकालयों जमा किया जा सकता है और एक उच्च प्रदर्शन NGS मशीन का उपयोग कर एक प्रवाह सेल लेन में अनुक्रम। कभी कभी डब्ल्यू mappability बढ़ाने के लिए पढ़ें लंबाई और अनुक्रम डीएनए टेम्पलेट के दोनों सिरों (बनती अंत) का विस्तार करने की भी सलाह दी जाती हैदोहराए जीनोमिक क्षेत्रों के भीतर chromatin मुर्गी का विश्लेषण।

इस प्रोटोकॉल ऐसे प्रतिलेखन कारक, संकेत मध्यस्थों और बाद translational हिस्टोन संशोधन के रूप में क्रोमेटिन सुविधाओं की एक विस्तृत विविधता को सफलतापूर्वक लागू किया गया है। वे विकास और chromatin प्रोफाइलों की व्याख्या करने के लिए कठिन हो जाते हैं लेकिन, जैसा कि भ्रूण सेलुलर विविधता की एक बढ़ती हुई डिग्री हासिल। होनहार चरणों सेल प्रकार विशिष्ट नाभिक ^38,39 निकालने के द्वारा ऊतक विशेष रूप से प्रोफाइल क्रोमेटिन परिदृश्य को एराबिडोप्सिस और ड्रोसोफिला में बनाया गया है। हमारी प्रोटोकॉल अन्य भ्रूण में ऊतक विशेष चिप Seq के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकता है जो एक परमाणु निष्कर्षण कदम शामिल हैं।

Materials

1/16 inch tapered microtip	Qsonica	4417	This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica.
8 ml glass sample vial with cap	Wheaton	224884	8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps.
Adaptor	IDT or Sigma	NA	TruSeq universal adaptor, AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C.
b2g4pipe (software)	Blast2GO	non-commercial	http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip
BLAST+ (software)	Camacho et al.	non-commercial	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download
Bowtie (software)	Langmead et al.	non-commercial	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
cisFinder (software)	Sharov et al.	non-commercial	http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/
Chip for capillary electrophoresis	Agilent Technologies	5067-1504	Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C.
Chip-based capillary electrophoresis system	Agilent Technologies	G2940CA	The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C.
ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit)	Kapa Biosystems	KK8504	Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C.
ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit)	Rubicon Genomics	R40048	Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C.
Cluster3 (software)	de Hoon et al.	non-commercial	http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster
FastQC (software)	Simon Andrews	non-commercial	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
Fluorometer	life technologies	Q32866	Qubit 2.0 Fluorometer
Fluorometer reagents	life technologies	Q32851	The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature.
Formaldehyde	Sigma	F8775-4X25ML	Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic.
Gel (E-Gel EX agarose , 2%)	life technologies	G4010	Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature.
Gel electrophoresis system	life technologies	G6465	E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries.
Gel extraction kit	Qiagen	28706	Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice.
HOMER (software)	Chris Benner	non-commercial	http://homer.salk.edu/homer/index.html
Hybridization oven	Techne	FHB1D	Hybridizer HB-1D
IGV (software)	Robinson et al.	non-commercial	http://www.broadinstitute.org/igv/home
Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software)	Assaf Gordon	non-commercial	http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter
Java TreeView (software)	Alok Saldanha	non-commercial	http://jtreeview.sourceforge.net
Laboratory jack	Edu-Lab	CH0642	This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication.
Ladder, 100 bp	New England BioLabs	N3231	Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C.
Ladder, 1 kb	New England BioLabs	N3232	Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C.
Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes	life technologies	AM12450	nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml
MACS2 (software)	Tao Liu	non-commercial	https://github.com/taoliu/MACS
Magnetic beads	life technologies	11201D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads	life technologies	11203D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads	life technologies	10001D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads	life technologies	10003D	These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic rack	life technologies	12321D	DynaMag-2 magnet
MEME	Bailey et al.	non-commercial	http://meme.nbcr.net/meme/
Na3VO4	New England BioLabs	P0758	Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C.
NaF	New England BioLabs	P0759	Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C.
NGS machine	Illumina	SY-301-1301	Genome Analyzer IIx
NGS machine (high performance)	Illumina	SY-401-2501	HiSeq
Normal serum (antibody control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2028	Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Normal serum (antibody control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025	Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Normal serum (antibody control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2027	Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Nucleic acid staining solution	iNtRON	21141	Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature.
Orange G	Sigma	O3756-25G	1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C.
PCR primers	e.g., IDT or Sigma	NA	Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C.
MinElute PCR purification kit	Qiagen	28006	for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature.
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9)	life technologies	AM9730	Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible.
Primer3 (software)	Steve Rozen & Helen Skaletsky	non-commercial	http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Protease inhibitor tablets	Roche	11836170001	cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C.
Protease inhibitor tablets	Roche	11873580001	cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C.
Proteinase K	life technologies	AM2548	proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C.
RNase A	life technologies	12091-039	RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature.
Rotator	Stuart	SB3	Rotator SB3
SAMtools (software)	Li et al.	non-commercial	http://samtools.sourceforge.neta
Solid phase reversible immobilisation beads	Beckman Coulter	A63882	The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C.
Sonicator 3000	Misonix/Qsonica	NA	Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin.
Sound enclosure	Misonix/Qsonica	NA	optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure.
Thermomixer	eppendorf	22670000	Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C.