Automatiserad Kvantifiering av hematopoetisk cell - stromacells- Interaktioner i Histologiska bilder från Undecalcified Bone
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Konfokalmikroskopi är metoden för analys av lokalisering av flera celltyper inom komplexa vävnader såsom benmärg. Dock är analysen och kvantifiering av cellulär lokalisering svårt, eftersom det i många fall är beroende av manuell räkning, vilket bär risken för att införa ett rater beroende fördomar och minska interbedömarreliabilitet. Dessutom är det ofta svårt att bedöma om samlokaliseringen mellan två celler resulterar från slumpmässig positionering, speciellt när celltyper skiljer sig starkt på frekvensen av deras förekomst. Här används en metod för objektiv kvantifiering av cellulär samlokalisering i benmärgen införts. Protokollet beskriver provberedning används för att erhålla histologiska sektioner av hela murina långa ben inklusive benmärgen, liksom färgningsprotokollet och förvärvet av högupplösta bilder. En analys arbetsflöde spänner från erkännandet av hematopoetiska och icke-Hemåtopoietic celltyper i 2-dimensionella (2D) benmärgs bilder till kvantifieringen av de direkta kontakterna mellan dessa celler presenteras. Detta omfattar även en stadsdel analys, för att få information om den cellulära mikromiljön som omger en viss celltyp. För att utvärdera huruvida co-lokalisering av två celltyper är det bara är resultatet av slumpmässig cellpositionering eller reflekterar förmånliga associationer mellan cellerna, ett simuleringsverktyg, som är lämpligt för att testa denna hypotes i fallet med hematopoetiska såväl som stromala celler, är användas. Detta tillvägagångssätt är inte begränsat till benmärgen, och kan utvidgas till andra vävnader för att möjliggöra reproducerbar, kvantitativ analys av histologiska data.
Introduction
På grund av den senaste tidens snabba tekniska utvecklingen inom mikroskopi, inklusive optisk avbildning, har analysen av celler inom ramen för hela vävnaden blir allt mer tillgänglig för immunologer. Karakterisering av enskilda celler i suspension är en värdefull och nödvändig metod för att förstå cellulära och molekylära funktionen. Dock är avgörande för att förstå samspelet mellan olika celltyper som samverkar i komplexa processer såsom utveckling av immunsvar analysen av cellerna i deras (mikro) -anatomical miljö.
Även om det är relativt lätt för microscopists att få kvalitativ information från bilder, är det fortfarande en utmaning att kvantifiera dessa uppgifter, dels på grund av det faktum att analysmetoder inom detta område släpar efter jämfört med vad som är möjligt i bilden förvärvet. Många forskare fortfarande förlitar sig på tidsödande manuell cellräkning i deras histologi bilder,därmed införa en bias bland olika bedömare och hindrar replikering av andra grupper. Ofta är en representativ bild valt att betona ett uttalande om cellulär position eller samlokalisering i en publikation, vilket gör det svårt för läsaren att bedöma den statistiska relevansen av en sådan händelse.
Tillsammans med det faktum att hela innehållet i bild datainformation sällan utnyttjas, betonar detta behovet av en mer objektiv, snabbare och övergripande strategi för att analysera histologiska bilder.
Benmärgen är en komplex vävnad, som tar på viktiga vitala funktioner som organ för blodbildningen hos vuxna ryggradsdjur. Förutom att vara födelseplatsen för hematopoetiska celler 1,2 och spela en viktig roll i B-lymfocyter utveckling 3, fungerar den också som en plats där immunreaktioner initieras 4 och stöder mogna, recirkulerande B-celler 5. Dessutom, dess roll i att upprätthålla immunological minne har blivit alltmer uppskattat under det senaste decenniet, eftersom flera typer av celler som utgör immunologiskt minne har funnit att vistas där 6-9.
Förhållandet mellan den komplexa vävnadsarkitektur benmärgen och dess funktioner fortfarande svårfångade. Till skillnad från sekundära lymfoida organ, som anordnas i makro fack såsom T- och B-cellszoner, saknar benmärgen en tydlig makro uppdelning. Hittills distinkta fack i benmärg definieras av sin närhet till benet cortex eller kärl. Betydelsen av de olika inhemska stromal cellpopulationer i benmärgen för ett antal processer som stöder stamceller, utveckling av B-celler eller underhåll av immunminnescellpopulationer (såsom långlivade plasmaceller (PC), CD4 + och CD8 + minnes-T-celler) visar tydligt att det finns en viss grad av mikro-uppdelning i benmärgen.
<pclass = "jove_content"> Dessa observationer har lett till begreppet distinkta microanatomical nischer, som är specialiserade på vissa funktioner (stamcells underhåll, B-cellsutveckling i olika skeden, och underhåll av immunologiskt minne) i benmärgen. Även om det verkar vara en viss grad av heterogenitet bland de nischer som tjänar olika funktioner, några av de faktorer som produceras av stromaceller, såsom CXC-kemokinligand 12 (CXCL12) eller interleukin 7 (IL-7), är viktiga delar för flera av dessa nischer 10. Visualiseringen och karakterisering av stromaceller i benmärgen är svårt på grund av deras morfologiska funktioner med långa, tunna dendritiska förlängningar bildar ett nätverk i hela benmärgen, och bristen på lämpliga markörer för att diskriminera stromala subpopulationer.Det är ännu inte klart i vilken utsträckning dessa nischer har gemensamma drag med avseende på deras cellulära och molekylära composition, och vilka faktorer gör en viss nisch unikt. Förutom stromaceller har hematopoetiska celltyper visat sig spela en avgörande roll genom att tillhandahålla vissa signaler åtminstone för en del av de nischer. Tydligt, komplexiteten i nisch sammansättningen kräver sin analys på plats, och det har blivit allt viktigare för immunologer och hematologer att zooma in på benmärgsmikroarkitektur, t.ex., genom att analysera de rumsliga relationer mellan dess cellulära komponenter.
Här, en strategi kvantifiera cellulära samlokalisering och grannskapsrelationer i benmärgen i ett automatiserat och opartiskt sätt presenteras. En detaljerad arbetsflöde med framtagning av chimera möss, hysande fluorescerande stromaceller och icke-fluorescerande hematopoetiska celler, beredning av histologiska snitt från undecalcified ben, förvärv av konfokala bilder som täcker hela benet, samt automatiserad bildanalys av cellulär co-lokalisering och validering / diskriminering från slumpmässig positionering av ett simuleringsverktyg tillhandahålls (Figur 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots framstegen i moderna optiska avbildningsmetoder, är analysen av histologiska uppgifter fortfarande ofta hindras av bristen på ordentliga kvantifiering verktyg och metoder, eller genom partiska analyser som fokuserar på ett litet område av intresse. Den synergistiska synsätt som presenteras här kombinerar bildanalys täcker hela benmärgen region automatiserade segmentering och objektdetektering av olika hematopoetiska och stromala celltyper, samlokalisering analys, och slutligen ett valideringsverktyg för i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Andreas Radbruch för värdefulla diskussioner. Vi är tacksamma för att Sabine Gruczek, Patrick Thiemann och Manuela Ohde för hjälp med djuromsorg och Robert Günther för utmärkt tekniskt stöd. Vi tackar våra utbildade bedömare Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florens Pache och Katharina Horn för utvärdering av histologiska prover och Randy Lindquist för korrekturläsning av manuskriptet. Vi tackar J. och N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA för MBP-specifika antikroppar.
Detta arbete stöddes av DFG HA5354 / 4-1, genom JIMI-bidrag DFG kärnanläggningen nätverk för intravital mikroskopi och TRR130 / TP17 och DFG FÖR 2165 (HA5354 / 6-1) till AEHSZ stöddes av Internationella Max Planck Skola för infektionssjukdomar och immunologi (IMPRS-IDI), Berlin.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
