Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Microscopia confocale è il metodo di scelta per l'analisi della localizzazione di molteplici tipi di cellule all'interno dei tessuti complessi come il midollo osseo. Tuttavia, l'analisi e la quantificazione di localizzazione cellulare è difficile, come in molti casi si basa sul conteggio manuale, portando così il rischio di introdurre una polarizzazione rater-dipendente e riducendo l'affidabilità interrater. Inoltre, è spesso difficile giudicare se la co-localizzazione tra due celle risultati di posizionamento casuale, soprattutto quando tipi cellulari differiscono fortemente la frequenza del loro verificarsi. Qui, viene introdotto un metodo per la quantificazione obiettiva cellulari co-localizzazione nel midollo osseo. Il protocollo descrive la preparazione del campione utilizzato per ottenere sezioni istologiche di intere murini ossa lunghe, compreso il midollo osseo, così come il protocollo di colorazione e l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Un flusso di lavoro di analisi che va dal riconoscimento di ematopoietiche e non-hemattipi di cellule opoietic in 2 dimensioni immagini midollo (2D) ossa alla quantificazione dei contatti diretti tra queste cellule è presentato. Questo include anche un'analisi quartiere, per ottenere informazioni sul microambiente cellulare che circonda un certo tipo di cellula. Per valutare se la co-localizzazione di due tipi di cellule è il semplice risultato del posizionamento cella casuale o riflette associazioni preferenziali tra le cellule, uno strumento di simulazione che è adatto per testare questa ipotesi nel caso di ematopoietiche e cellule stromali, è utilizzato. Questo approccio non è limitato al midollo osseo, e può essere estesa ad altri tessuti per consentire riproducibili, analisi quantitativa dei dati istologici.
Introduction
A causa di recenti sviluppi tecnologici rapidi microscopio, tra cui imaging ottico, l'analisi di cellule nel contesto di tutto il tessuto è diventato sempre più accessibile per immunologi. La caratterizzazione di singole cellule in sospensione rappresenta un metodo prezioso e indispensabile per comprendere la funzione cellulare e molecolare. Tuttavia, l'analisi delle cellule all'interno del loro (micro) ambiente -anatomical è essenziale per la comprensione delle interazioni tra i vari tipi di cellule che collaborano in processi complessi come lo sviluppo delle risposte immunitarie.
Mentre è relativamente facile per microscopisti di ottenere informazioni qualitative da immagini, rimane una sfida per quantificare questi dati, in parte a causa del fatto che i metodi di analisi in questo campo sono in ritardo rispetto a quanto è possibile in acquisizione dell'immagine. Molti ricercatori si affidano ancora a conteggio manuale delle cellule nelle loro immagini istologici che richiede tempo,introducendo così una polarizzazione tra i diversi valutatori e ostacolare la replica da parte di altri gruppi. Spesso, una immagine rappresentativa viene scelto per sottolineare una dichiarazione sulla posizione di cellulare o di co-localizzazione in una pubblicazione, il che rende difficile per il lettore a giudicare la rilevanza statistica di un tale evento.
Insieme con il fatto che l'intero contenuto informazioni di dati dell'immagine è raramente sfruttata, questo sottolinea la necessità di un approccio più imparziale, veloce e completo per analizzare immagini istologiche.
Il midollo osseo è un tessuto complesso, che assume importanti funzioni vitali come organo di ematopoiesi in vertebrati adulti. Oltre ad essere il luogo di nascita di cellule ematopoietiche 1,2 e giocando un ruolo importante nello sviluppo dei linfociti B 3, agisce anche come un luogo in cui vengono avviate le reazioni immunitarie 4 e supporta, le cellule B mature ricircolo 5. Inoltre, il suo ruolo nel mantenere imemoria mmunological è diventato sempre più apprezzato negli ultimi dieci anni, come sono stati trovati per soggiornarvi 6-9 diversi tipi di cellule che costituiscono la memoria immunitaria.
Il rapporto tra l'architettura tissutale complesso del midollo osseo e delle sue funzioni rimangono ancora sfuggente. A differenza di organi linfoidi secondari, che sono organizzati in macro-comparti, come le zone delle cellule T e B, il midollo osseo non ha un chiaro macro-compartimentazione. Finora compartimenti distinti nel midollo osseo sono definite dalla loro vicinanza al corticale ossea o vascolare. L'importanza delle varie popolazioni cellulari stromali residenti nel midollo osseo per un certo numero di processi come le cellule staminali di supporto, sviluppo di cellule B o manutenzione di popolazioni di cellule immunitarie memoria (quali cellule plasmatiche lunga durata (PC), CD4 + e CD8 + cellule T di memoria) indica chiaramente che vi sia un certo grado di micro-compartimentalizzazione nel midollo osseo.
<pclass = "jove_content"> Queste osservazioni hanno portato al concetto di nicchie microanatomical distinte, che sono specializzati in alcune funzionalità (staminali mantenimento delle cellule, lo sviluppo delle cellule B in varie fasi, e il mantenimento della memoria immunologica) nel midollo osseo. Anche se sembra esserci una certa eterogeneità tra le nicchie che servono diverse funzioni, alcuni dei fattori prodotte dalle cellule stromali, quali CXC-chemochina legante 12 (CXCL12) o interleuchina 7 (IL-7), sono componenti essenziali per molte di queste nicchie 10. La visualizzazione e la caratterizzazione delle cellule stromali del midollo osseo è difficile a causa delle loro caratteristiche morfologiche con lunghi, sottili estensioni dendritiche formando una rete attraverso il midollo osseo, e la mancanza di marcatori appropriati per discriminare sottopopolazioni stromali.Non è ancora chiaro in quale misura queste nicchie condividono caratteristiche comuni rispetto alla loro compositio cellulare e molecolaren, e quali elementi rendono una certa nicchia unico. Oltre alle cellule stromali, tipi di cellule ematopoietiche hanno dimostrato di giocare un ruolo cruciale fornendo alcuni segnali almeno per alcune delle nicchie. Chiaramente, la complessità della composizione nicchia richiede loro analisi in situ, ed è diventato sempre più importante per immunologi e hematologists per ingrandire osseo microarchitettura ossea, ad esempio, analizzando le relazioni spaziali tra i suoi componenti cellulari.
Qui, una strategia per quantificare cellulari co-localizzazione e di vicinato relazioni nel midollo osseo in modo automatizzato e imparziale è presentato. Un flusso di lavoro dettagliate inclusa la generazione di topi chimerici, l'ospitare cellule fluorescenti stromali e cellule ematopoietiche non fluorescenti, preparazione di sezioni istologiche di ossa undecalcified, acquisizione di immagini confocali coprono l'intero osso, così come l'analisi delle immagini automatizzata di c cellulareo-localizzazione e la convalida / discriminazione dal posizionamento casuale per uno strumento di simulazione è fornito (Figura 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante i progressi in moderni metodi di imaging ottico, l'analisi dei dati istologica è ancora spesso ostacolato dalla mancanza di strumenti di quantificazione ei modi, o da analisi parziali che si concentrano su una piccola area di interesse. L'approccio sinergico qui presentato combina analisi dell'immagine che copre l'intera regione di midollo osseo, la segmentazione automatica e rilevamento di oggetti di diversi tipi di cellule ematopoietiche e stromali, analisi co-localizzazione, ed infine uno …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Andreas Radbruch per le discussioni di valore. Siamo grati a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde per l'assistenza con la cura degli animali e Robert Günther per un'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo i nostri valutatori qualificati Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache e Katharina Horn per la valutazione dei campioni istologici e Randy Lindquist per revisione del manoscritto. Ringraziamo J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, Stati Uniti d'America per gli anticorpi MBP-specifici.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla DFG HA5354 / 4-1, da Jimi-una sovvenzione nucleo DFG rete impianto per la microscopia intravitale e TRR130 / TP17 e DFG PER 2165 (HA5354 / 6-1) per AEHSZ è stata sostenuta dalla Max Planck Internazionale Scuola per le Malattie Infettive e Immunologia (IMPRS-IDI), Berlino.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
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