Automatiseret Kvantificering af hæmatopoietisk celle - stromacelle Interaktioner i Histologiske Billeder af afkalkede Bone
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Konfokal mikroskopi er den foretrukne metode til analyse af lokaliseringen af flere celletyper inden for komplekse væv, såsom knoglemarv. Er imidlertid vanskelig analyse og kvantificering af cellulær lokalisering, som i mange tilfælde er afhængig af manuel optælling, således bærer risikoen for at indføre et Rater-afhængig fordomme og reducere pålidelighed mellem. Desuden er det ofte vanskeligt at vurdere, om co-lokalisering mellem to celler resultater fra tilfældig placering, især når celletyper varierer stærkt i hyppigheden af deres forekomst. Her indføres en fremgangsmåde til objektiv kvantificering af cellulær co-lokalisering i knoglemarven. Protokollen beskriver fremstillingen prøve anvendes til at opnå histologiske snit af hele murine lange knogler, herunder knoglemarven, samt farvningsprotokol og erhvervelse af billeder med høj opløsning. En analyse workflow, der spænder fra anerkendelsen af hæmatopoietisk og ikke-Hematopoietic celletyper i 2-dimensionelle (2D) knoglemarv billeder til kvantificering af de direkte kontakter mellem de celler præsenteres. Dette omfatter også et kvarter analyse at få oplysninger om den cellulære mikromiljø omkring en bestemt celletype. For at vurdere, om co-lokalisering af to celletyper er den blotte resultat af tilfældig celle positionering eller reflekterer præferentielle associationer mellem cellerne, en simulation værktøj, der er egnet til at teste denne hypotese i tilfælde af hæmatopoietiske samt stromaceller, er anvendes. Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til knoglemarv, og kan udvides til andre væv til at tillade reproducerbar, kvantitativ analyse af histologiske data.
Introduction
På grund af den seneste hastige teknologiske udvikling inden mikroskopi, herunder optisk billeddannelse, har analysen af celler i sammenhæng med hele væv blevet stadig tilgængelige for immunologer. Karakteriseringen af enkelte celler i suspension er en værdifuld og uundværlig metode til at forstå cellulære og molekylære funktion. Men analysen af cellerne i deres (mikro) -anatomical miljø er afgørende for at forstå samspillet mellem forskellige celletyper, der samarbejder i komplekse processer såsom udvikling af immunrespons.
Selv om det er forholdsvis let for microscopists at indhente kvalitative oplysninger fra billeder, er det stadig en udfordring at kvantificere disse data, dels på grund af det faktum, at analysemetoder på dette område halter bagefter i forhold til hvad der er muligt i billedoptagelse. Mange forskere stadig er afhængige af tidskrævende manuel celletælling i deres histologiske billeder,således at indføre en skævhed mellem forskellige raters og hindrer replikation af andre grupper. Ofte er en repræsentant billede valgt at understrege en erklæring om cellulær position eller co-lokalisering i en publikation, hvilket gør det svært for læseren at bedømme statistisk relevans af en sådan begivenhed.
Sammen med det faktum, at det fulde indhold af billeddata information sjældent udnyttes, understreger dette behovet for en mere saglig, hurtigere og omfattende tilgang til at analysere histologiske billeder.
Knoglemarven er et komplekst væv, der tager vigtige vitale funktioner som organ for hæmatopoiese hos voksne hvirveldyr. Ud over at være fødestedet for hæmatopoietiske celler 1,2 og spiller en vigtig rolle i B-lymfocytter udvikling 3, det fungerer også som et sted, hvor immunreaktioner igangsættes 4 og støtter modne, recirkulerende B-celler 5. Desuden dens rolle i at opretholde immunological hukommelse er blevet stadig mere værdsat i det sidste årti, som flere typer af celler, der udgør immunhukommelse har vist sig at opholde sig der 6-9.
Relationen mellem den komplekse væv arkitektur knoglemarven og dens funktioner er stadig undvigende. I modsætning til sekundære lymfoide organer, som er organiseret i makro-rum såsom T og B-celle zone, mangler knoglemarven en klar makro-opdeling. Hidtil adskilte rum i knoglemarv er defineret ved deres nærhed til benet cortex eller kar. Betydningen af de forskellige hjemmehørende stromal cellepopulationer i knoglemarven for en række processer såsom støtte stamceller, udvikling af B-celler eller vedligeholdelse af immunologisk hukommelse cellepopulationer (såsom langlivede plasma celler (PC), CD4 + og CD8 + hukommelses-T-celler), viser klart, at der er en vis grad af mikro-opdeling i knoglemarven.
<pclass = "jove_content"> Disse observationer har ført til begrebet særskilte microanatomical nicher, der er specialiseret i bestemte funktionaliteter (stamcelle vedligeholdelse, B-celle udvikling på forskellige stadier, og vedligeholdelse af immunologisk hukommelse) i knoglemarven. Selv om der synes at være en vis grad af heterogenitet blandt de nicher, der tjener forskellige funktioner, nogle af de faktorer produceret af stromale celler, såsom CXC-kemokinligand 12 (CXCL12) eller interleukin 7 (IL-7), er afgørende elementer for flere af disse nicher 10. Visualiseringen og karakterisering af stromale celler i knoglemarven er vanskelig på grund af deres morfologiske træk med lange, tynde dendritiske extensions danner et netværk i hele knoglemarven, og manglen på egnede markører til at skelne stromale subpopulationer.Det er endnu ikke klart, i hvilket omfang disse nicher deler fællestræk med hensyn til deres cellulære og molekylære Sammensætningn, og hvilke elementer gør en bestemt niche unik. Ud over stromaceller har hæmatopoietiske celletyper blevet vist at spille en afgørende rolle ved at give visse signaler i det mindste for nogle af nicher. Det er klart, kompleksiteten af niche sammensætning kræver deres analyse på stedet, og det er blevet stadig vigtigere for immunologer og hæmatologer at zoome ind på knoglemarv mikroarkitektur, fx ved at analysere de rumlige forhold mellem cellulære komponenter.
Her til en strategi kvantificere cellulære co-lokalisering og naboskab relationer i knoglemarven i en automatiseret og fordomsfri måde præsenteres. En detaljeret workflow herunder produktion af kimære mus, der huser fluorescerende stromaceller og ikke-fluorescerende hæmatopoietiske celler, fremstilling af histologiske snit fra afkalkede knogler, erhvervelse af konfokale billeder dækker hele knogle, såvel som automatiseret billedanalyse af cellulær co-lokalisering og validering / diskrimination fra tilfældig placering af et simuleringsværktøj leveres (figur 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
På trods af de fremskridt i moderne optiske billeddiagnostiske metoder, er analysen af histologiske data stadig ofte hæmmet af mangel på ordentlig kvantificering værktøjer og metoder, eller ved fordomsfulde analyser, der fokuserer på et lille område af interesse. Den synergistiske tilgang præsenteres her kombinerer billedanalyse dækker hele knoglemarven region, automatiseret segmentering og objekt anerkendelse af forskellige hæmatopoietiske og stromale celletyper, co-lokalisering analyse, og endelig en v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Andreas Radbruch for værdifulde diskussioner. Vi er taknemmelige for Sabine Gruczek, Patrick Thiemann og Manuela Ohde for hjælp til pasning af dyr og Robert Günther for fremragende teknisk bistand. Vi takker vores uddannede raters Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache og Katharina Horn for evaluering af histologiske prøver og Randy Lindquist for korrekturlæsning af manuskriptet. Vi takker J. og N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA for MBP-specifikke antistoffer.
Dette arbejde blev støttet af DFG HA5354 / 4-1, af Jimi-en DFG kerne facilitet netværk tilskud til intravital mikroskopi og ved TRR130 / TP17 og DFG FOR 2165 (HA5354 / 6-1) til AEHSZ blev støttet af Den Internationale Max Planck School for infektionssygdomme og Immunologi (IMPRS-IDI), Berlin.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
