Automatisert Kvantifisering av Hematopoietiske Cell - stromal Cell Samhandling i Histologiske Bilder av Undecalcified Bone
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Konfokalmikroskopi er metoden for valg for analyse av lokalisering av flere celletyper innenfor komplekse vev som benmargen. Imidlertid er analyse og kvantifisering av cellulær lokalisering vanskelig, som i mange tilfeller er avhengig av manuell telling, og dermed bærer risiko for å innføre en rater avhengig forspenning, og reduserer pålitelighet mellom. Dessuten er det ofte vanskelig å bedømme om ko-lokalisering mellom to celler resulterer fra tilfeldig posisjonering, særlig når celletyper avviker sterkt i hyppigheten av forekomsten. Her er en fremgangsmåte for objektiv kvantifisering av celle co-lokalisering i benmargen innført. Protokollen beskriver prøven oppkjøpet av bilder med høy oppløsning preparat som brukes for å skaffe histologiske snitt av hele murine lange bein inkludert benmargen, samt farging protokollen og. En analyse arbeidsflyt spenner fra anerkjennelsen av blodkreft og ikke-Hematopoietic celletyper i to-dimensjonale (2D) benmargs bilder til kvantifisering av de direkte kontakter mellom disse cellene blir presentert. Dette inkluderer også et nabolag analyse, for å få informasjon om den cellulære mikromiljøet rundt en bestemt celletype. For å evaluere hvorvidt ko-lokalisering av to celletyper er det bare på grunn av tilfeldig celle posisjonering eller reflekterer gunstige forbindelser mellom cellene, et simuleringsverktøy som er egnet til å teste denne hypotesen i tilfelle av hematopoetiske samt stromale celler, er anvendes. Denne fremgangsmåten er ikke begrenset til benmargen, og kan utvides til andre vev for å tillate reproduserbare, kvantitativ analyse av histologiske data.
Introduction
Med hensyn til det siste hurtige utvikling innen mikroskopi, inkludert optisk imaging, har analyse av cellene i sammenheng med hele vevet blitt stadig tilgjengelig for immunologer. Karakteriseringen av enkeltceller i suspensjon representerer en verdifull og uunnværlig metode for å forstå cellulære og molekylære funksjon. Det er imidlertid viktig for forståelsen av interaksjonen mellom forskjellige celletyper som samarbeider i komplekse prosesser som for eksempel utvikling av immunresponser analyse av cellene i deres (mikro) -anatomical miljø.
Mens det er relativt enkelt for microscopists å innhente kvalitativ informasjon fra bilder, er det fortsatt en utfordring å kvantifisere disse dataene, delvis på grunn av det faktum at metoder analyse på dette området henger etter i forhold til hva som er mulig i bildet oppkjøpet. Mange forskere fortsatt stole på tidkrevende manuell celletelling i sine histologi bilder,dermed innføre en skjevhet blant ulike raters og hindre replikering av andre grupper. Ofte, en representant bilde valgt å understreke en uttalelse på mobil stilling eller samlokalisering i en publikasjon, noe som gjør det vanskelig for leseren å bedømme den statistiske relevansen av en slik hendelse.
Sammen med det faktum at den fulle informasjonsinnholdet i bildedata sjelden utnyttes, understreker dette behovet for en mer objektiv, raskere og omfattende tilnærming for å analysere histologiske bilder.
Benmargen er en kompleks vev, som tar på viktige vitale funksjoner som organ for hematopoiesen hos voksne virveldyr. Foruten å være fødestedet for blodkreft cellene 1,2 og spiller en viktig rolle i B-lymfocytter utvikling 3, fungerer det også som et sted hvor immunreaksjoner er initiert fire og støtter modne, resirkulerende B-celler fem. I tillegg er dets rolle i å opprettholde immunological minne har blitt stadig mer verdsatt i det siste tiåret, som flere typer celler som utgjør immun minne har blitt funnet å oppholde seg der 6-9.
Forholdet mellom den komplekse vevsarkitektur av benmargen og dens funksjoner fortsatt unnvikende. I motsetning til sekundære lymfoide organer, som er organisert i makro avdelinger som T- og B-celle-soner, mangler benmargen en klar makro compartmentalization. Så langt forskjellige avdelinger i benmargen er definert av deres nærhet til beinet cortex eller blodkar. Betydningen av de forskjellige hørende stromale cellepopulasjoner i benmargen for en rekke prosesser som støtter stamceller, utvikling av B-celler eller vedlikehold av immunminnecellepopulasjoner (slik som langvarige plasmaceller (PC-er), CD4 + og CD8 + T-celler minne) viser klart at det er en viss grad av mikro-compartmentalization i benmargen.
<pclass = "jove_content"> Disse observasjonene har ført til begrepet distinkte microanatomical nisjer, som er spesialisert på visse funksjoner (stamcelle vedlikehold, B-celle utvikling på ulike stadier, og vedlikehold av immunologisk hukommelse) i benmargen. Selv om det synes å være en viss grad av heterogenitet blant nisjer som tjener forskjellige funksjoner, og noen av de faktorer som produseres av stromale celler, slik som CXC-kjemokin-ligand 12 (CXCL12) eller interleukin 7 (IL-7), er viktige komponenter for flere av disse nisjene 10. Visualisering og karakterisering av stromale celler i benmargen er vanskelig på grunn av deres morfologiske funksjoner med lange, tynne dendrittiske utvidelser danner et nettverk over hele benmargen, og mangelen på egnede markører for å diskriminere stromal subpopulasjoner.Det er ennå ikke klart i hvilken grad disse nisjene dele fellestrekk med hensyn til deres cellulært og molekylært composition, og hvilke elementer gjengi en viss nisje unik. I tillegg til stromale celler, hematopoetiske celletyper har vist seg å spille en avgjørende rolle ved å tilveiebringe visse signaler i hvert fall for noen av nisjene. Åpenbart kompleksiteten i nisje sammensetning krever sin analyse in situ, og det har blitt stadig viktigere for immunologer og Hematologer å zoome inn på benmargen mikroarkitektur, f.eks, ved å analysere romlige relasjoner mellom sine cellulære komponenter.
Her, til en strategi kvantifisere cellulære samlokalisering og nabolag relasjoner i benmargen i en automatisert og objektiv måte er presentert. En detaljert arbeidsflyt inkludert generering av kimære mus, husing fluorescerende stromale celler og ikke-fluorescerende hematopoetiske celler, fremstilling av histologiske seksjoner fra undecalcified bein, anskaffelse av konfokale bilder som dekker hele benet, samt den automatiserte bildeanalyse av cellulær co-lokalisering og dens validering / diskriminering fra tilfeldig posisjonering av et simuleringsverktøy er gitt (Figur 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for fremgang i moderne optiske avbildningsmetoder, er analysen av histologiske data fortsatt ofte hindret av mangel på skikkelig kvantifisering verktøy og metoder, eller av forutinntatte analyser som fokuserer på et lite område av interesse. Den synergistisk tilnærming som presenteres her kombinerer bildeanalyse som dekker hele benmargen regionen, automatisert segmentering og objekt anerkjennelse av ulike blodkreft og stromal celletyper, samlokalisering analyse, og til slutt en valideringsverktøyet av ik…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Andreas Radbruch for verdifulle diskusjoner. Vi er takknemlige for Sabine Gruczek, Patrick Thiemann og Manuela Ohde for å få hjelp med dyr omsorg og Robert Günther for utmerket teknisk assistanse. Vi takker våre opplærte raters Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache og Katharina Horn for evaluering av histologiske prøver og Randy Lindquist for korrekturlesing av manuskriptet. Vi takker J. og N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA for MBP-spesifikke antistoffer.
Dette arbeidet ble støttet av DFG HA5354 / 4-1, av Jimi-en DFG kjernefasiliteten nettverk stipend for intramikroskopi og ved TRR130 / TP17, og DFG FOR 2165 (HA5354 / 6-1) til AEHSZ ble støttet av den internasjonale Max Planck skole for infeksjonssykdommer og immunologi (IMPRS-IDI), Berlin.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
