Ex Utero Elektroporering og organotypisk Slice kultur Mouse Hippocampal Tissue
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
Hippocampus spiller en vigtig rolle i hukommelse og indlæring samt følelsesmæssig adfærd. En funktion vigtigste består i konsolideringen af korttidshukommelsen i langtidshukommelsen, som kræver høj plasticitet af nervesystemet. Gyrus dentatus i hippocampus fungerer som den primære gateway for input information og er også en af to områder af hjernen med igangværende neurogenese gennem hele voksenlivet 1,2. Udviklingen af hippocampus struktur sker under sen embryogenese og især i de første 3 til 4 uger efter fødslen 3. I den tidlige udvikling af gyrus dentatus en stamcelle pool etableres nødvendig for postnatal samt voksen neurogenese 4. Udvikling neuroner passerer gennem forskellige stadier, fra stamceller gennem flere stadier af stamceller til umodne og endelig den modne neuron under postnatal samt voksen neurogenese. På forskellige stadier af neurogenese udtryk forspecifikke gener er nødvendig for at gøre det muligt for modning og integration af nye neuroner i hippocampus kredsløb 5,6.
Ved hjælp af musen genetik og fænotype-analyse ved immunohistokemi samt molekylære metoder tilladt definere ekspressionsmønster og funktion af mange af disse gener. Desuden microarray analyse samt kromatin immunoprecipitation (chip) givet oplysninger om potentielle direkte og indirekte målgener 7,8. Men der er stadig mange åbne spørgsmål vedrørende de regulatoriske mekanismer hippocampal udvikling, især udviklingen af gyrus dentatus. For at få yderligere indsigt hvordan specifikke gener reguleres et system kræves tillader manipulation af et lille antal celler ved ned- eller opregulering af genet af interesse og / eller dets målgener og følge deres skæbne under udvikling. I livmoderen elektroporation af shRNAs, cDNA af gener af interesse eller Cre recombinaSE giver et sådant værktøj. For at sikre tilstedeværelsen af det ønskede DNA eller små RNA ekspressionsplasmider bør anvendes til elektroporation. Denne fremgangsmåde er meget gennemført med succes i at studere cortical udvikling 9,10, men er en mere udfordrende tilgang undersøge udviklingen af gyrus dentatus grund af placeringen af de hippocampale strukturer i dybere hjerne lag.
Ex utero elektroporation efterfulgt af organotypisk skive kultur er en metode til at omgå dette problem 11,12. I modsætning til in utero elektroporation ikke hele embryo, men kun hovedet anvendes tillader derfor at placere elektroderne i en mere gunstig måde at lede shRNA / DNA mod hippocampus og gyrus dentatus. Vores gruppe med held ex utero elektroporation at studere rollen af transkriptionsfaktoren Bcl11b under gyrus dentatus udvikling 8. Bcl11b har en dobbelt rolle i tandede gyrus udvikling ved regulating progenitor celleproliferation samt differentiering som blev påvist ved immunhistokemi. For yderligere at definere en mekanisme til Bcl11b deltagelse i disse processer, er protokoller til Polleux gruppe 11,12 justeres for at studere den tandede gyrus som beskrevet nedenfor i protokollen sektion. I en første tilgang til spørgsmålet var rettet, om Bcl11b regulerer neuronal celledifferentiering celle selvstændigt. En anden metode undersøgt desmoplakin, et direkte mål gen Bcl11b, er tilstrækkelig til at redde Bcl11b fænotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hippocampus har en vigtig funktion i indlæring og hukommelse. Den tandede gyrus er også en af to hjerneområder, hvor neurogenese optræder ikke kun under udvikling, men også gennem hele voksenlivet. Fødselsdepression og voksne hippocampus neurogenese provenu på samme måde involverer mange lighedspunkter. Definition de regulatoriske mekanismer disse faktorer vil være meget nyttigt at forstå neurodegenerative sygdomme, hvilket igen vil føre til nye behandlingsformer og forebyggende foranstaltninger. For at…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neurosciences. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
