Ex Utero L'électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
L'hippocampe joue un rôle important dans la mémoire et l'apprentissage ainsi que le comportement émotionnel. Une fonction principale consiste en la consolidation de la mémoire à court terme en mémoire à long terme, qui exige une forte plasticité du système nerveux. Le gyrus denté de l'hippocampe joue le rôle de passerelle principale pour obtenir des informations d'entrée et est également l'une des deux régions du cerveau avec la neurogenèse continue à l'âge adulte 1,2. Le développement de la structure de l'hippocampe se produit à la fin de l'embryogenèse et en particulier pendant la première 3 à 4 semaines après la naissance 3. Au début du développement de la gyrus denté un pool de cellules souches est établi nécessaire pour postnatale ainsi que la neurogenèse adulte 4. Les neurones en développement passent par différentes étapes, à partir de la cellule souche à travers plusieurs stades de cellules progénitrices immatures au neurone et enfin la maturité pendant postnatal ainsi que la neurogenèse adulte. À différentes étapes de la neurogenèse l'expression degènes spécifiques est nécessaire pour permettre la maturation et l'intégration de nouveaux neurones dans les circuits de l'hippocampe 5,6.
En utilisant la génétique de souris et analyse phénotypique par immunohistochimie ainsi que des méthodes moléculaires a permis de définir le profil d'expression et la fonction d'un grand nombre de ces gènes. Dans l'analyse des microréseaux d'addition ainsi que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) fourni des informations sur les gènes cibles potentiels directs et indirects 7,8. Cependant, il ya encore beaucoup de questions ouvertes concernant les mécanismes de régulation de développement de l'hippocampe, en particulier le développement du gyrus denté. Pour mieux comprendre comment les gènes spécifiques sont réglementés un système est nécessaire permettant la manipulation d'un petit nombre de cellules par le bas ou vers le haut-régulation du gène d'intérêt et / ou de ses gènes cibles et suivre leur sort au cours du développement. In utero électroporation des shRNA, ADNc de gènes d'intérêt ou Cre recombinaSE fournit un tel outil. Pour garantir la présence de l'ADN désiré ou petits ARN des plasmides d'expression doit être utilisée pour l'électroporation. Cette approche est mise en œuvre avec succès dans l'étude du développement cortical 9,10, mais est une approche plus difficile l'examen de l'évolution de la gyrus denté en raison de la position des structures de l'hippocampe dans les couches plus profondes du cerveau.
Électroporation in utero Ex suivie par la culture organotypique est une approche pour contourner ce problème 11,12. Contrairement à électroporation in utero pas l'embryon entier, mais seule la tête est utilisée permet donc de placer les électrodes d'une manière plus favorable pour diriger le shRNA / ADN vers l'hippocampe et le gyrus denté. Notre groupe a utilisé avec succès l'électroporation ex utero pour étudier le rôle de facteur de transcription Bcl11b cours du développement du gyrus denté 8. Bcl11b a un double rôle dans le développement de gyrus denté par regulating prolifération de cellules souches ainsi que la différenciation comme cela a été démontré par immunohistochimie. Pour définir plus précisément un mécanisme d'engagement Bcl11b dans ces procédés, les protocoles du groupe Polleux 11,12 ont été ajustés pour étudier le gyrus denté comme décrit ci-dessous dans la section de protocole. Dans une première approche de la question a été posée de savoir si Bcl11b réglemente neuronale cellule de la différenciation cellulaire autonome. Une deuxième approche a examiné si Desmoplakine, un gène cible directe de Bcl11b, est suffisante pour sauver le phénotype Bcl11b.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'hippocampe joue un rôle important dans l'apprentissage et la mémoire. Le gyrus denté est aussi l'une des deux régions du cerveau où se produit la neurogenèse non seulement au cours du développement, mais aussi à l'âge adulte. Postnatale et adultes produit neurogenèse hippocampique d'une manière similaire impliquant de nombreux facteurs communs. Définir les mécanismes de régulation de ces facteurs sera très utile dans la compréhension des maladies neurodégénératives qui à son tou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neurosciences. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
