Ex Utero Electroporation og organotypiske Slice Culture of Mouse hippocampus Tissue
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
Hippocampus spiller en viktig rolle i hukommelse og læring, og emosjonell adferd. En hovedfunksjon består av konsolideringen av korttidshukommelsen til langtidshukommelsen, som krever høy plastisitet av nervesystemet. Dentate gyrus av hippocampus fungerer som det primære gateway for inngangsinformasjon og er også en av to hjerneregioner med løpende nevrogenesen gjennom voksen 1,2. Utviklingen av hippocampus struktur oppstår under sent embryogenese og spesielt i første 3 til 4 uker etter fødselen 3. Under tidlig utvikling av dentate gyrus en stamcelle basseng er etablert nødvendig for postnatal samt voksen neurogenesis 4. Utviklings nevroner passere gjennom ulike stadier, fra stamcelle gjennom flere stadier av stamceller til umoden og endelig moden nervecellen under fødselen, samt voksen neurogenesis. På ulike stadier av neurogenesis uttrykk forspesifikke gener som er nødvendig for å tillate modning og integrering av nye nerveceller i hippocampus kretsen 5,6.
Ved å bruke musen genetikk og fenotype analyse ved immunhistokjemi samt molekylære metoder tillatt å definere uttrykket mønster og funksjon av mange av disse gener. I tillegg microarray analyse samt kromatin immunoprecipitation (chip) gitt informasjon om potensielle direkte og indirekte mål gener 7,8. Men det er fortsatt mange åpne spørsmål om regulatoriske mekanismer for hippocampus utvikling, spesielt utviklingen av dentate gyrus. For å få ytterligere innsikt hvor spesifikke gener reguleres et system er nødvendig å tillate manipulering av et lite antall celler ved ned- eller opp-regulering av genet av interesse og / eller deres målgener og følge deres skjebne under utvikling. I utero elektroporering av shRNAs, cDNA av gener av interesse eller Cre recombinaSE gir et slikt verktøy. For å sikre nærvær av de ønskede DNA eller RNA små ekspresjonsplasmider skal brukes for elektroporering. Denne fremgangsmåten er svært vellykket implementert i å studere kortikal utvikling 9,10, men er en mer utfordrende tilnærming å undersøke utviklingen av dentate gyrus på grunn av posisjonen av hippocampus strukturer i hjernen dypere lag.
Ex utero elektroporering fulgt av organotypic skive kultur er en tilnærming for å omgå dette problemet 11,12. I motsetning til in utero elektroporering ikke hele embryoet, men bare den hode brukes slik derfor å plassere elektrodene i en mer fordelaktig måte å dirigere shRNA / DNA inn i hippocampus og dentate gyrus. Vår gruppe med hell anvendes ex utero elektroporering for å studere rollen til transkripsjonsfaktor Bcl11b under dentate gyrus utvikling 8. Bcl11b har en dobbel rolle i dentate gyrus utvikling av regulating progenitor-celle proliferasjon, så vel som differensierings som ble demonstrert ved immunohistokjemi. For ytterligere å definere en mekanisme for Bcl11b involvering i disse prosessene, ble protokollene fra gruppen Polleux 11,12 justert for å studere dentate gyrus, som beskrevet nedenfor i protokollinformasjonen. I en første tilnærming spørsmålet var adressert om Bcl11b er å regulere nervecelledifferensiering celle selvstendig. En annen tilnærming undersøkt om Desmoplakin, en direkte målgen av Bcl11b, er tilstrekkelig til å redde Bcl11b fenotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hippocampus har en viktig funksjon i læring og hukommelse. Dentate gyrus er også en av to områder av hjernen hvor nevrogenesen oppstår ikke bare under utvikling, men også gjennom hele voksenlivet. Postnatal og voksne hippocampus nevrogenesen proveny på en lignende måte som involverer mange felles faktorer. Definere reguleringsmekanismer for disse faktorene vil være svært nyttig i å forstå nevrodegenerative sykdommer som i sin tur vil føre til nye behandlingsformer og forebyggende tiltak. For å få denne inf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neurosciences. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
