Ex Utero Elektroporation och Organotypic Slice Kultur av Mouse hippocampus Tissue
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
Hippocampus spelar en viktig roll i minne och inlärning samt känslomässigt beteende. En huvudfunktion består av en konsolidering av korttidsminnet till långtidsminnet, vilket kräver hög plasticitet i nervsystemet. Dentate gyrus av hippocampus fungerar som den primära gateway för inmatad information och är också en av två områden i hjärnan med pågående neurogenes genom hela vuxenlivet 1,2. Utvecklingen av hippocampus strukturen sker under sen embryogenes och i synnerhet under den första 3 till 4 veckor efter födseln 3. Under tidiga utvecklingen av gyrus dentatus en stamcellspoolen är etablerad krävs för postnatal samt vuxenneurogenes 4. Utvecklings nervceller passerar genom olika stadier, från stamcell genom flera stadier av progenitorceller till omogna och slutligen den mogna neuron under postnatal samt vuxenneurogenes. I olika skeden av neurogenes uttrycket avspecifika gener krävs för att göra det möjligt för mognaden och integration av nya nervceller i hippocampus kretsen 5,6.
Använda mus genetik och fenotypanalys genom immunhistokemi samt molekylära metoder tillåts definiera expressionsmönster och funktion av många av dessa gener. Dessutom microarray analys samt kromatin immunoprecipitation (chip) lämnade information om potentiella direkta och indirekta målgener 7,8. Men det finns fortfarande många obesvarade frågor beträffande regler hos hippocampus utveckling, i synnerhet utvecklingen av gyrus dentatus. För att få ökad insikt om hur specifika gener regleras ett system krävs tillåter manipulering av ett litet antal celler med ned- eller uppreglering av genen av intresse och / eller dess målgener och följer deras öde under utveckling. I livmodern elektroporering av shRNAs, cDNA av gener av intresse eller Cre recombinaSE erbjuder ett sådant verktyg. För att garantera närvaron av de önskade DNA eller små-RNA uttryckningsplasmider bör användas för elektroporering. Detta tillvägagångssätt är mycket framgångsrikt genomfört studera kortikal utveckling 9,10, men är en mer utmanande strategi att undersöka utvecklingen av gyrus dentatus grund av läget för de hippocampus strukturer i djupare hjärnlager.
Ex livmodern elektroporering, följt av organotypic bit kultur är en strategi för att kringgå detta problem 11,12. I motsats till i livmodern elektroporering inte hela embryot utan bara huvudet används tillåter därför att placera elektroderna i ett mer gynnsamt sätt att rikta shRNA / DNA mot hippocampus och gyrus dentatus. Vår grupp framgångsrikt använts ex livmodern elektroporering för att studera rollen av transkriptionsfaktorn Bcl11b under gyrus dentatus utveckling 8. Bcl11b har en dubbel roll i gyrus dentatus utveckling genom regulating stamcellstransplantation proliferation samt differentiering som visades av immunohistokemi. För att ytterligare definiera en mekanism för Bcl11b inblandning i dessa processer, har protokoll från Polleux gruppen 11,12 justeras för att studera gyrus dentatus som beskrivs nedan i protokoll avsnittet. I ett första tillvägagångssätt frågan riktades huruvida Bcl11b reglerar neuronal celldifferentiering cell autonomt. Ett andra tillvägagångssätt undersöktes om desmoplakin, en direkt målgen av Bcl11b, är tillräcklig för att rädda Bcl11b fenotypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hippocampus har en viktig funktion i inlärning och minne. Gyrus dentatus är också en av två områden i hjärnan där neurogenes sker inte bara under utvecklingen, utan även under hela vuxenlivet. Födsel och vuxna hippocampus neurogenes skrider på ett liknande sätt som involverar många gemensamma faktorer. Definiera regler hos dessa faktorer kommer att vara till stor hjälp för att förstå neurodegenerativa sjukdomar som i sin tur kommer att leda till nya behandlingar och förebyggande åtgärder. För att få…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neurosciences. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
