Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür
Summary
Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.
Abstract
Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.
Introduction
hipokampus bir hafıza ve öğrenmede önemli rol yanı sıra duygusal davranış oynar. Bir ana işlevi sinir sisteminin yüksek plastisite gerektiren uzun süreli belleğe kısa süreli hafıza konsolidasyon oluşur. hipokampus dentat girus giriş bilgileri için birincil ağ geçidi gibi davranır ve yetişkinlik 1,2 genelinde de devam eden nöron iki beyin bölgelerinden biri olduğunu. Hipokampal yapının geliştirilmesi geç embriyojenez sırasında ve özellikle de ilk 3-4 hafta postnatal 3 sırasında meydana gelir. Dentate erken gelişimi sırasında kök hücre havuzu yetişkin nöron 4 yanı sıra postnatal için gerekli kurdu olan gyrus. Gelişmekte nöronlar postnatal yanı sıra yetişkin nöron sırasında olgunlaşmamış ve nihayet olgun nöron progenitör hücrelerin çeşitli aşamalardan kök hücreden, çeşitli aşamalardan geçer. Nöron ifadesi farklı aşamalarındaBelirli genler hipokampal devresi 5,6 içine olgunlaşmasını ve yeni nöronların entegrasyonu sağlamak için gereklidir.
Bu genlerin çoğunun ifade desen ve fonksiyon tanımlayan izin fare genetik ve immünohistokimyasal olarak fenotip analizinin yanı sıra moleküler yöntemler kullanılarak. Ilave mikroarray analizi gibi kromatin immunoprecipitation (ChIP) potansiyel doğrudan ve dolaylı hedef genlerin 7,8 hakkında bilgi verdi. Ancak, kıvrımlarının gelişiminde özellikle hipokampal gelişim düzenleyici mekanizmaları ile ilgili pek çok açık sorular, hala vardır. Aşağı veya yukarı-regülasyonu faiz ve / veya hedef genlerin ve gelişim sırasında kaderlerini takip geninin spesifik genlerin hücre az sayıda manipülasyon izin gerekli bir sistem nasıl düzenlendiği ileri fikir edinmek için. Utero elektroporasyon shRNAs, ilgi veya Cre recombina genlerinin cDNAse böyle bir araç sağlar. Elektroporasyon için kullanılmalıdır arzu edilen DNA ya da küçük RNA'ların sentezleme plazmidlerin varlığını sağlamak. Bu yaklaşım çok başarılı nedeniyle derin beyin tabakalarında hipokampal yapıların konumuna dentat girus gelişimini inceleyen bir daha zorlu bir yaklaşım kortikal gelişimini 9,10 okuyan uygulanan, ancak mesafesindedir.
Organotipik dilim kültür ardından Ex utero elektroporasyon bu sorunu aşmak 11,12 bir yaklaşımdır. Aksine utero elektroporasyon değil bütün embriyo ancak kafa nedenle hipokampus ve dentat girus doğru shRNA / DNA doğrudan daha uygun bir şekilde elektrotlar yerleştirmek için izin kullanılan mi. Grubumuz başarıyla dentat girus gelişimi 8 sırasında transkripsiyon faktörü Bcl11b rolünü incelemek için ex utero elektroporasyon istihdam. Bcl11b r tarafından dentat girus gelişiminde ikili bir rolü vardırimmünohistokimya ile gösterilmiş olduğu üzere, progenitör hücre çoğalması aynı zamanda farklılaşma egulating. Bundan başka, bu işlemlerde Bcl11b katılımı için bir mekanizma olarak tanımlamak için, Polleux grubunun 11,12 protokoller, protokol bölümünde aşağıda anlatıldığı gibi dentat girus çalışma ayarlanmıştır. İlk yaklaşımda soru Bcl11b özerk nöronal hücre farklılaşması hücre düzenleyen olup olmadığını ele alındı. İkinci bir yaklaşım Desmoplakin, Bcl11b doğrudan hedef gen, Bcl11b fenotip kurtarmak için yeterli olup olmadığı incelenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
hipokampus öğrenme ve hafızada önemli bir işleve sahiptir. dentat girus da nöron gelişimi sırasında aynı zamanda yetişkinlik boyunca sadece oluşur iki beyin bölgelerinden biridir. Doğum sonrası ve bir çok yaygın faktörleri söz konusu eden benzer bir şekilde, yetişkin hipokampal nöron ilerler. Bu faktörlerin düzenleyici mekanizmaların tanımlanması da yeni tedaviler ve önleyici tedbirlere yol açacaktır nörodejeneratif hastalıkların anlaşılmasında çok yararlı olacaktır. Bu bilgiyi edi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10X | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neurosciences. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
