प्ररूपी विश्लेषण और के लिए मानव त्वचा से लिम्फोसाइट अलगाव<em> पूर्व विवो</em> सेल संस्कृति
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
मानव त्वचा के एक महत्वपूर्ण बाधा समारोह है और विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि ऊतक homeostasis और रोगाणुओं से संरक्षण के लिए योगदान होता है। के रूप में त्वचा का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, यह परिधीय प्रतिरक्षा नियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है। स्वस्थ त्वचा के आचरण immunosurveillance में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के निवासी, लेकिन यह भी इस तरह के सोरायसिस के रूप में भड़काऊ त्वचा रोग, के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उभरते अंतर्दृष्टि के बावजूद, जीव विज्ञान विभिन्न भड़काऊ त्वचा रोगों अंतर्निहित के बारे में हमारी समझ अभी भी सीमित है। अच्छी गुणवत्ता (एकल) सेल biopsied त्वचा के नमूनों से पृथक आबादी के लिए एक की जरूरत है। अब तक, अलगाव प्रक्रियाओं को गंभीरता से व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त की कमी के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है। अलगाव और बाद के विश्लेषण भी वर्तमान हदबंदी प्रक्रियाओं की वजह से प्राप्त करने के लिए यांत्रिक और रासायनिक तनाव के कारण, प्रतिरक्षा सेल वंश मार्कर के नुकसान से प्रभावित किया गया हैएकल कक्ष निलंबन। यहाँ, हम यांत्रिक त्वचा हदबंदी के संयोजन एक स्वचालित ऊतक dissociator और collagenase उपचार का उपयोग करके दोनों स्वस्थ है और इसमें शामिल psoriatic मानव त्वचा से टी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए एक संशोधित विधि का वर्णन है। इस पद्धति एकल कक्ष निलंबन की तैयारी पर ऐसी सीडी 4, सीडी 8, Foxp3 और CD11c के रूप में सबसे प्रतिरक्षा वंश मार्करों की अभिव्यक्ति को बरकरार रखता है। सफल सीडी 4+ टी सेल अलगाव और बाद में प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण के उदाहरण दिखाए जाते हैं।
Introduction
त्वचा, शरीर और पर्यावरण के बीच प्राथमिक इंटरफेस के रूप में, बाहरी भौतिक, रासायनिक और ऐसे लोग घायल हो गए, पराबैंगनी विकिरण और सूक्ष्म जीवों के रूप में जैविक अपमान के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। त्वचा की दो मुख्य डिब्बों, एपिडर्मिस और डर्मिस शामिल हैं, और Langerhans कोशिकाओं, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी), और लगभग 20 अरब स्मृति टी कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक किस्म है, लगभग दो बार पूरे रक्त की मात्रा 1 में नंबर उपस्थित होता है 2। डेटा के एक बढ़ती शरीर धारणा है कि त्वचा, आवश्यक प्रतिरक्षा कार्य किया है दोनों ऊतक homeostasis के दौरान और विभिन्न रोग की स्थिति में समर्थन करता है। इम्यून सामान्य त्वचा में निवासी कोशिकाओं immunosurveillance 3 संचालन करने के लिए लगा रहे हैं और इस तरह के सोरायसिस 4 के रूप में भड़काऊ विकारों के विकास में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। Psoriatic lesional त्वचा में, दोनों सीडी 4 + और सीडी 8 + घुसपैठ की टी कोशिकाओं OBS थेerved और यह दिखाया गया था कि सीडी 4 और सीडी 8 के अनुपात से रोग की स्थिति 5 पर निर्भर करता है। हालांकि, कोशिकाओं की इन आबादियों अध्ययन करने के लिए है, क्योंकि मौजूदा तकनीक केवल कुछ कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति मुश्किल हो जाता है।
मानव त्वचा से टी सेल अलगाव के लिए वर्तमान में व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक enzymatic उपचार के साथ यांत्रिक त्वचा हदबंदी गठबंधन। मानव त्वचा बायोप्सी बड़े पैमाने पर कीमा और trypsin, collagenase और / या EDTA 6-8 की तरह एंजाइमों के साथ incubated हैं। यह देखते हुए कि त्वचा एक बाधा ऊतक जो उच्च तन्यता बलों और मैकेनिकल disaggregation के लिए प्रतिरोधी है, टी सेल अलगाव के तरीकों की स्थापना बहुत कुछ कोशिकाओं, और व्यवहार्य कोशिकाओं की भी कम संख्या है, जो इन सेल आबादी के पूर्व vivo सेल संस्कृति बनाता है कठिन और उत्पादन चुनौतीपूर्ण।
यहाँ, हम mechan के संयोजन से दोनों स्वस्थ है और इसमें शामिल psoriatic मानव त्वचा से लिम्फोसाइट अलग करने के लिए एक संशोधित विधि रिपोर्टत्वचा की राजनैतिक हदबंदी, एक स्वचालित ऊतक dissociator के बजाय बड़े पैमाने पर नख़रेबाज़ की स्थापना की विधि का उपयोग enzymatic पाचन कोलैजिनेज़ उपयोग करने के साथ एक साथ। विभिन्न व्यवहार्य प्रतिरक्षा सेल डीसी और टी कोशिकाओं सहित सबसेट एक एकल कोशिका निलंबन की तैयारी के बाद मनाया गया। महत्वपूर्ण बात सतह मार्कर CD3, सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था। कोशिकाओं को इस तरह से तैयार है, पूर्व vivo सेल संस्कृतियों या प्रवाह cytometric विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एकल त्वचा बायोप्सी (4 मिमी) सोरायसिस के मरीजों की lesional त्वचा से ली गई है के विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है। नतीजे बताते हैं कि त्वचा निवासी रोगी टी कोशिकाओं को स्वस्थ स्वयंसेवकों से 9 आईएल -17 और IFNγ की तरह अधिक भड़काऊ साइटोकिन्स उत्पादन की तुलना में।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत कुशलता से मानव त्वचा बायोप्सी से त्वचा निवासी टी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए। इस प्रोटोकॉल का लाभ व्यवहार्य लिम्फोसाइटों के अपेक्षाकृत उच्च संख्या के अलगाव है, और प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सोरायसिस रोगियों से त्वचा बायोप्सी कृपया डा एंड्रियास Koerber वैज्ञानिक प्रयोग के लिए मौखिक या लिखित सूचित सहमति के बाद (Essen, जर्मनी के विश्वविद्यालय में त्वचा विज्ञान विभाग) द्वारा प्रदान किया गया।
XH भी NSFC 61263039 और 11101321 NSFC द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
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