表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em> ex vivoで</em>細胞培養
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
人間の皮膚は重要なバリア機能を有しており、病原体からの組織の恒常性と保護に貢献様々な免疫細胞が含まれています。肌がアクセスすることは比較的容易であるように、それは末梢免疫制御メカニズムを研究するための理想的なプラットフォームを提供します。免疫常駐健康な皮膚行動免疫監視中の細胞だけでなく、乾癬のような炎症性皮膚疾患の発達において重要な役割を果たしています。新興洞察力にもかかわらず、様々な炎症性皮膚疾患の根底にある生物学の我々の理解はまだ限られています。生検皮膚試料から単離された良質な（単一）細胞集団が必要です。これまでに、単離手順は、深刻な生存細胞の十分な数を得ることの欠如によって妨げられてきました。単離およびその後の分析にも得ることが、現在の解離手順によって引き起こされる機械的及び化学的ストレスに起因する免疫細胞系統マーカーの損失の影響を受けています単一細胞懸濁液。ここでは、自動化された組織の解離及びコラゲナーゼ処理を用いた機械的皮膚解離を組み合わせることにより、健康と関係する両方の乾癬のヒト皮膚からT細胞を単離するために修正された方法を記載します。この方法は、単一細胞懸濁液を調製する際に、このようなCD4、CD8、Foxp3をおよびCD11cなど、ほとんどの免疫系統マーカーの発現を保持します。成功したCD4 + T細胞の単離およびその後の表現型および機能的分析の例が示されています。
Introduction
皮膚は、身体と環境との間の主要なインタフェースとして、外部からの物理的、化学的、およびそのような創傷、紫外線や微生物などの生物学的傷害に対する防御の最初の行を提供します。皮膚は、主に2つのコンパートメント、表皮と真皮を含み、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、樹状細胞（DC）、および約200億メモリーT細胞を含む免疫細胞の様々な含まれ、全体の血液量1、ほぼ2倍の数の本、2。データの成長体は、皮膚が組織の恒常性の間、および様々な病理学的状態の両方で、本質的な免疫学的機能を持っているという概念をサポートしています。正常な皮膚内に存在する免疫細胞を、免疫学的監視3を実施するために考えられ、例えば、乾癬4のような炎症性疾患の発症において役割を果たすことが示されています。乾癬病変皮膚では、CD4 +およびCD8 +の両方のT細胞がOBSた浸潤しましたervedそれはCD4とCD8の比率は、疾患状態5に応じて変化することが示されました。しかし、細胞のこの集団は、既存の技術は、ほんのわずかの細胞の単離を可能にするため、研究するのが困難です。
ヒトの皮膚からのT細胞の単離のために現在広く用いられている技術は、酵素処理と機械的に皮膚解離を兼ね備えています。ヒトの皮膚生検は、広範囲に刻み、トリプシン、コラゲナーゼおよび/ またはEDTA 6-8のような酵素でインキュベートします。皮膚は、引張力および機械的分解に非常に抵抗性であるバリア組織であることを考慮すると、T細胞の単離の確立された方法は、これらの細胞集団の困難およびex vivo細胞培養を行い、非常に少数の細胞および生細胞のより低い番号を生成します挑戦。
ここでは、mechanを組み合わせることにより、健康で関与両方乾癬ヒトの皮膚からリンパ球を単離するための改良法を報告します酵素消化は、コラゲナーゼを使用して一緒に、自動化された組織の解離の代わりに広くミンチの確立された方法を用いて、皮膚のiCalの解離。 DCおよびT細胞を含む種々の生存免疫細胞サブセットを、単一細胞懸濁液の調製後に観察されました。重要な表面マーカーCD3、CD4とCD8の発現がよく保存されていました。このようにして調製した細胞は、ex vivoでの細胞培養またはフローサイトメトリー分析に使用するための準備ができています。このプロトコルは、正常乾癬患者の病変皮膚に由来する単一の皮膚生検（4 mm）での分析のために使用されています。その結果、皮膚常駐患者のT細胞は、健康なボランティア9と比較して、IL-17及びIFNγのような多くの炎症性サイトカインを産生することを示しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、効率的にヒトの皮膚生検からの皮膚常在T細胞を単離するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの利点は、実行可能なリンパ球の比較的高い数の分離であり、関連する表面マーカーを発現します。同定された細胞のサブセットは以下の通りであった：たCD11c + DCは、CD4 +およびCD8 + T細胞とのFoxp3 + CD25 +細胞。重要なのは、孤立した?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
乾癬患者からの皮膚生検を親切に科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に博士アンドレアスKoerber（エッセン、ドイツの大学の皮膚科部門）によって提供されました。
XHはまた、NSFC 61263039とNSFC 11101321でサポートされています。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
