Mosaic zebrafisk Transgenese for Funktionel Genomisk analyse af kandidatlandenes Cooperative gener i Tumor Patogenese

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Kræft er fremadskridende sygdomme præget af ophobning af patologiske mutationer, deletioner og kromosomfejl gevinster over tid. Disse genetiske abnormiteter kan påvirke flere cellulære processer spænder fra cellecyklussen, celledød, energisk metabolisme og samling af cytoskelettet at understrege reaktioner såsom hypoxi. Derfor tumorigenesis afspejler de kollektive aktioner fra flere genetiske afvigelser på tværs af et spektrum af biologiske processer. Seneste integrationsfremmende genomiske forskningsindsats, herunder hele genomsekventering, exome sekventering, målrettet sekventering, dyb sekventering og genom-dækkende associationsstudier, har identificeret et stigende antal nye genetiske ændringer i stort set alle typer af tumorer ^1-4. I mange tilfælde, de genetiske læsioner forekommer sammen i et ikke tilfældigt måde ^5-8, hvilket tyder på deres samarbejde i sygdom patogenese. Dissekere onkogene roller bred vifte af afvigende udtrykte gener som følge from disse genomiske læsioner er nødvendigt at udarbejde nye terapeutiske strategier og til at forstå svarene fra tumorceller til disse midler, men dette har vist sig at være en skræmmende opgave, der kræver meget robuste dyremodelsystemer for gennemførelsen af high-throughput funktionel genomisk analyse vivo.

Selv pattedyr, især gnavere, er stillede modeller i cancer biologi har zebrafisk begyndt at tiltrække stor opmærksomhed. Den teleost zebrafisk (Dario rerio) er blevet anvendt som en model organisme til udvikling undersøgelse siden 1960'erne og først blev anvendt til studiet af tumor patogenese i 1982 ^9-11. Nem vedligeholdelse, lille kropsstørrelse, og høj frugtbarhed gør zebrafisk en robust model for store forward genetiske skærme til at identificere mutationer, som bibringer unormale og patologiske fænotyper ^10. Den optiske gennemsigtighed zebrafisk embryoner er en anden vigtig funktion understøtter mere udbredt anvendelse af denne kræftform model, somdet giver in vivo imaging, der skal udføres for at lokalisere tumor udvikling i realtid ^9, et program, der er relativt vanskeligt i gnavere ^12. Seneste komparativ genomforskning analyse af zebrafisk henvisning genom (Zv9) afslørede 26.206 protein-kodende gener, med 71%, der har menneskelige orthologer, hvoraf 82% er korreleret med sygdomsassocierede gener i Online Mendelsk nedarvning i Man database (OMIM) ^{13, 14.} Følgelig har zebrafisk blevet anvendt til at modellere forskellige typer af humane cancere, herunder neuroblastom ^8, T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) ^15,16, melanom ^17,18, Ewings sarkom ¹⁹ rhabdomyosarcom ^20,21, pancreatisk carcinom ^22, hepatocellulært carcinom ²³ og myeloid malignitet ^24,25, og er blevet udvalgt som en kræft model for xenotransplantation studerer ^11,26.

En stabil transgenfremgangsmåde i zebrafisk er almindeligt anvendt til at undersøge virkningen af gain-of-funktion af gener i normale udvikling eller sygdom patogenese ^27,28. At udvikle en sådan model (figur 1A), en injicerer en DNA-konstruktion, der indeholder genet af interesse drives af en vævsspecifik promotor i en celle vildtype-embryoner. Tre til fire måneder efter injektionen, da de injicerede embryoner bliver kønsmodne, bliver de udkrydsede med vildtype-fisk til at screene for dem, der viser integration af DNA-konstruktionen i deres kimcellelinje, som licenser dem som grundlægger fisk. Mange faktorer, såsom antallet kopi og integration site af transgenet, påvirker ekspression af transgenet i stabile transgene linjer. Således at udvikle en transgen tumormodel, flere stabile transgene linier, som overudtrykker en enkelt onkogen skal genereres først og screenes for linjen udtrykker transgenet på et niveau, der kunne føre til tumor induktion. Hvis overekspression af en kandidat oncogene er toksisk for kimceller, er det vanskeligt at frembringe en stabil transgen linje ved direkte overudtrykker transgenet ^29. Derfor kan denne fremgangsmåde være tidskrævende, med en høj risiko for fejl for at generere en egnet cancer model.

Her illustrerer vi en alternativ strategi baseret på mosaik forbigående transgenese (figur 1B), som tilvejebringer unikke fordele i forhold til traditionelle stabil transgenese til funktionel genomisk undersøgelse in vivo. I denne fremgangsmåde er en eller flere transgene konstruktioner injiceres i en celle stadiet af transgene eller vildtype-embryoner. De injicerede DNA-konstruktioner, der indeholder transgener er så mosaically og tilfældigt integreret i den primære indsprøjtet fisk, hvilket resulterer i blandede genotyper indenfor flere cellepopulationer i de enkelte fisk ^30. Desuden injektion af flere DNA-konstruktioner i en celle embryoer fører til co-integration i den samme celle på tilfældige steder, tillader en at TRAce cellerne med ekspression af transgener og udforske samspillet mellem forskellige gener under sygdom patogenese i mosaik dyr ^31. Som bevis principielt vi transient overudtrykt mutation aktiveret ALK (F1174L) med mCherry reportergen i det perifere sympatiske nervesystem (PSNS) under kontrol af dopamin beta hydroxylase (d βh) promotoren i vildtype fisk og transgene fisk overudtrykker MitCN. ALK, der koder for et receptortyrosinkinase, er den hyppigst muterede gen i høj risiko neuroblastom ^5-7,32,33. ALK (F1174L), som en af de hyppigste og potente somatiske aktiverende mutationer, er overrepræsenteret i MYCN- forstærket neuroblastom patienter med høj risiko og synergistisk med MitCN overekspression at fremskynde neuroblastom tumorgenese både stabile transgene mus og transgene zebrafisk modeller ^8,34,35. Ved mosaikforbigående overekspression af ALK (F1174L) med mCherry i MitCN transgene fisk, vi gentaget fremskyndelse af tumor indtræden observeret i den stabile transgene fisk overudtrykker både ALK (F1174L) og MitCN, tyder på, at mosaik transgenese strategi kan anvendes til hurtigt og effektivt vurdere de relative bidrag fra flere onkogener i tumor initiering in vivo.

Protocol

BEMÆRK: Alle zebrafisk undersøgelser og vedligeholdelse af dyrene blev udført i overensstemmelse med Mayo Clinic Institute IACUC-godkendt protokol # A41213. 1. DNA-konstruktioner til Transgenese Amplificere et 5,2 kb dopamin beta hydroxylase (d βh) promotorregionen 8 ved hjælp af CH211-270H11 BAC klon (fra BacPac midler center (BPRC)) som en DNA-template. Brug et PCR-system egnet til lange og præcis PCR-amplifikation af lange DNA-templates og følgende cy…

Representative Results

For at undersøge om overekspression af mutation aktiveret ALK F1174L eller vildtype-ALK kunne samarbejde med MitCN i neuroblastom induktion, vi overudtrykt enten aktiveret human ALK eller vild-type human ALK under kontrol af d βh promotor i PSNS af transgene fisk, der overudtrykker MitCN. En af følgende konstruktioner, dβh – ALKF1174L eller dβh – ALKWT, blev co-injiceret med dβh – mCherry i én-cell…

Discussion

I denne repræsentativ undersøgelse, brugte vi forbigående coinjektion og co-ekspression af aktiveret ALK med mCherry reporter genet i MitCN udtrykkende transgene fisk at vise, at disse gener samarbejder om markant fremskynde starten af neuroblastom, i overensstemmelse med vores tidligere fund i forbindelse stabil transgene fisk co-udtrykke både aktiverede ALK og MitCN ^8. Denne mosaik transgene fremgangsmåde har flere særskilte fordele i forhold til den konven…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY