पोस्ट-transcriptionally विनियमित जीन का रासायनिक Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
ट्रांसक्रिप्शनल और बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन दोनों जीनों की अभिव्यक्ति पर गहरा प्रभाव पड़ता है। हालांकि, आमतौर पर अपनाया सेल आधारित स्क्रीनिंग assays के अनिवार्य रूप से प्रमोटर-लक्ष्य अणुओं की पहचान करने के उद्देश्य से किया जा रहा है, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन पर ध्यान केंद्रित। नतीजतन, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र काफी हद तक जीन अभिव्यक्ति लक्षित दवा के विकास का पर्दाफाश किया जाता है। यहाँ हम, और इसे संशोधित करने में सक्षम यौगिकों की पहचान करने में अपनी mRNA की भाग्य के मॉडुलन में 3 'untranslated क्षेत्र (3' UTR) की भूमिका की जांच करने के उद्देश्य से एक सेल आधारित परख का वर्णन है। परख stably एक रोग-प्रासंगिक सेल लाइन में एकीकृत ब्याज की एक जीन के 3 'UTR से युक्त एक luciferase संवाददाता निर्माण के उपयोग पर आधारित है। प्रोटोकॉल इलाज के 24 घंटे के बाद luciferase गतिविधि को प्रभावित करने वाले अणुओं की पहचान करने के उद्देश्य से प्राथमिक स्क्रीनिंग पर प्रारंभिक ध्यान देने के साथ, दो भागों में बांटा गया है। प्रोटोकॉल के दूसरे भागवर्णन करता जवाबी स्क्रीनिंग विशेष रूप से 3 'UTR के माध्यम से luciferase गतिविधि modulating यौगिकों भेदभाव करने के लिए आवश्यक है। विस्तृत प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम के अलावा, हम परख विकास और अंतर्जात लक्ष्य पर हिट (एस) की मान्यता के बारे में महत्वपूर्ण विचार प्रदान करते हैं। वर्णित सेल आधारित रिपोर्टर जीन परख वैज्ञानिकों ने एक 3 'UTR पर निर्भर के बाद ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र के माध्यम से प्रोटीन का स्तर modulating अणुओं की पहचान करने की अनुमति देगा।
Introduction
जीन अभिव्यक्ति की एक लंबी अवधि ट्रांसक्रिप्शनल नियमन के लिए प्रोटीन के उत्पादन को नियंत्रित करने में नहीं विशेष भूमिका अगर एक प्रमुख खेलने के लिए सोचा था। सबूत जमते, हालांकि, बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन सेलुलर प्रोटीन बहुतायत 1,2 निर्धारित करने के लिए के रूप में ज्यादा है, अगर नहीं, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की तुलना में अधिक योगदान देता है कि इंगित करता है। जीन की अभिव्यक्ति के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण पहले सोचा था पर था की तुलना में अधिक जटिल और विस्तृत है। वास्तव में, के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के सभी विभिन्न चरणों mRNA के प्रसंस्करण, स्थानीयकरण, कारोबार, अनुवाद 3 के साथ ही नव वर्णित प्रतिवर्ती आरएनए मेथिलिकरण 4 सहित विनियमित करने में उभरा है। पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन प्रक्रियाओं के एक नंबर के संभावित प्रभावित से, परख नीचे वर्णित mRNA के 3 'untranslated क्षेत्र (3' UTR) शामिल उन पर केंद्रित है। 3 'UTR से मोटे तौर पर शाही सेना के बंधन जनसंपर्क के विशिष्ट बातचीत के माध्यम से मुख्य रूप से mRNA के भाग्य को प्रभावित करता हैअपनी विनियामक दृश्यों और / या माध्यमिक संरचनाओं से 5 oteins और गैर-कोडिंग RNAs। इसलिए, इन मुलाकातों को बदलने या नदी के ऊपर संकेत पारगमन रास्ते के साथ हस्तक्षेप है कि छोटे अणुओं प्रोटीन बहुतायत को नियंत्रित करता है कि शेष बदलाव होगा। यह चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए जो सबूत रोग-प्रासंगिक जीनों इस प्रकार औषधीय हस्तक्षेप के लिए एक संभावित लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है जो पद-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, के अधीन हैं दिखा रहा है कि मौजूद मानव विकृतियों के लिए विशेष महत्व का है। इसलिए, एक उच्च throughput प्रारूप में पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण तंत्र के साथ हस्तक्षेप के माध्यम से mRNA स्तर 'modulators के स्क्रीनिंग के लिए अनुमति सिस्टम संभावित उपन्यास उपचार की पहचान करने में कीमती उपकरण बन सकता है।
वर्णित सेल आधारित रिपोर्टर जीन परख अपनी 3 'UTR पर निर्भर तंत्र के माध्यम से mRNA के भाग्य मिलाना करने में सक्षम यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह कई प्राचार्य सी के होते हैंomponents (चित्रा 1) और कुछ प्रारंभिक चरणों की आवश्यकता है परख की व्यवहार्यता को मान्य करने के लिए। सबसे पहले, संवाददाता निर्माण ब्याज की एक जीन से 3 'UTR से शामिल करने के लिए बनाया गया है। 3 'UTR से इस तरह के जुगनू luciferase (चित्रा 1) के रूप में एक पत्रकार जीन के अंत से जुड़े हुए है। डाला 3 'UTR के माध्यम से exerted के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण तंत्र में कोई भी परिवर्तन विभिन्न luciferase स्तर में जिसके परिणामस्वरूप, इस चिमेरिक प्रतिलेख की स्थिरता और / या अनुवाद दक्षता बदल जाएगा। इसलिए, luciferase गतिविधि में परिवर्तन ब्याज की जीन के प्रभावित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के रूप में अप्रत्यक्ष उपाय काम करते हैं। प्रणाली के दूसरे घटक एक नियंत्रण संवाददाता का निर्माण, एक ही रिपोर्टर जीन व्यक्त करता है, लेकिन किसी भी 3 'UTR से शामिल नहीं करता है कि एक समान अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है। दो रिपोर्टर प्लास्मिड पारंपरिक आणविक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में बनाया गया है या वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा जा सकता है।
एक उपयुक्त सेल लाइन का चयन परख निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है। जो सेल लाइन इष्टतम मॉडल है उपलब्धता, transfectability, और विकास विशेषताओं की तरह सिर्फ व्यावहारिक मुद्दों को विकृति के लिए अधिक से अधिक समानता जैसे नैदानिक आवश्यकताओं से लेकर कई कारकों पर निर्भर करता है। महत्वपूर्ण बात है, पहले एक पत्रकार जीन के लिए 3 'UTR का फ्यूजन चिमेरिक प्रतिलेख के स्तर पर एक उम्मीद प्रभाव पड़ता है सुनिश्चित करना चाहिए कि आगे बढ़ने के लिए। 3 से luciferase संकेत में महत्वपूर्ण अंतर के अभाव वैकल्पिक लोगों की खोज के लिए उत्साह, UTR से इस सेलुलर मॉडल में कार्यशील नहीं है 'UTR असर और नियंत्रण संवाददाता क्षणिक तीन संकेत मिलता है कि चयनित कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट constructs'। उच्च throughput प्रारूप के लिए, 3 'UTR असर और नियंत्रण luciferase संवाददाता निर्माणों stably चयनित सेल लाइन में एकीकृत किया जाना चाहिए। का प्रयोग एक stably क्षणिक अधिक एकीकृत ट्रांसफ़ेक्टसेल लाइन कई कारणों के लिए बेहतर है। यह लागत कम, अभिकर्मक दक्षता में उतार-चढ़ाव से उत्पन्न होने वाले डाटा में परिवर्तनशीलता में कमी, हार्ड-transfect सेल लाइनों सहित एक सेलुलर मॉडल के चुनाव को व्यापक होगा। इसके अलावा, क्षणिक अभिकर्मक कोशिकाओं पर बहुत बार सिस्टम की संतृप्ति के लिए अग्रणी एक डीएनए प्लाज्मिड के साथ अतिभारित हैं। इन स्थितियों में संवाददाता अभिव्यक्ति में एक और वृद्धि संभावित upregulating यौगिकों की दिशा में कमी हुई संवेदनशीलता, जिसके परिणामस्वरूप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
सभी परख घटकों को स्थापित कर रहे हैं जब luciferase गतिविधि वास्तव में ऊपर और नीचे विनियमित '3 डाला के माध्यम से विशेष रूप से किया जा सकता है अगर अंत में, यह, परख, यानी की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए उच्च throughput प्रारूप में जाने से पहले महत्वपूर्ण है UTR। सबसे अच्छा नियंत्रण ब्याज के 3 'UTR के माध्यम से mRNA की स्थिरता या translatability मिलाना सूचना दी छोटे अणुओं होगा। इन चल रहा हैसंभव नहीं, वांछित प्रभाव नकल सरोगेट नियंत्रण स्वीकार कर रहे हैं। ये miRNAs या ब्याज के 3 'UTR के लिए बाध्य करने के माध्यम से अपने प्रभाव डालती के लिए जाना जाता आरएनए बंधनकारी प्रोटीन हो सकता है। इस तरह के नियंत्रण का मूल्यांकन प्राथमिक जांच विकसित की परख की कार्यक्षमता को इंगित करता है, लेकिन यह भी उच्च throughput प्रारूप में अपनी गतिशील रेंज, संवेदनशीलता और प्रदर्शन के आकलन के लिए अनुमति देता है न केवल पहले।
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हम एक 2000-यौगिक पुस्तकालय छह की जांच की। Neuroblastoma, बचपन की सबसे आम extracranial ठोस ट्यूमर, एक जैविक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था और जिसका प्रवर्धन MYCN ओंकोजीन, के 3 'UTR से दृढ़ता से एक लक्ष्य जीन के रूप में 7 neuroblastoma के प्रतिकूल परिणाम, भविष्यवाणी की है। दो प्रयोगात्मक लेआउट रूपरेखा चित्रा। स्क्रीनिंग एक समय में जांच 27 प्लेटों के बैच के आकार के साथ तीन रन में विभाजित किया गया था। 27 प्लेटों के बैच स्पेक्ट्रम संग्रह पुस्तकालय शामिलप्लेटों n.1-n.8 + n.25 (पहला भाग), n.9-n.16 + n.25 (दूसरा रन) और n.16-n.24 + n.25 (तृतीय रन), प्रत्येक थाली तीन प्रतियों में जांच की। इस प्रकार, एक पुस्तकालय प्लेट (n.25) संभव इंटर रन की तुलना करने के लिए सभी तीन रन के भीतर assayed किया गया था। प्रोटोकॉल के नीचे तीन प्रतियों में परीक्षण 9 पुस्तकालय प्लेटों की एक भी रन का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
