Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Sia trascrizionale e regolazione post-trascrizionale hanno un profondo impatto sulla espressione dei geni. Tuttavia, i saggi di screening basati su cellule comunemente adottati concentrarsi sulla regolazione trascrizionale, essendo essenzialmente finalizzata alla identificazione di molecole promotore-targeting. Come risultato, meccanismi post-trascrizionali sono ampiamente privi di espressione genica sviluppo di farmaci mirati. Qui si descrive un saggio basato su cellule finalizzata a studiare il ruolo di 'regione non tradotta (3' UTR 3) nella modulazione del destino del suo mRNA, e ad identificare composti in grado di modificarlo. Il saggio si basa sull'impiego di un costrutto reporter di luciferasi contenente la 3 'UTR di un gene di interesse stabilmente integrati in una linea cellulare malattie rilevanti. Il protocollo è diviso in due parti, con la messa a fuoco iniziale sul screening primario finalizzato alla identificazione di molecole che influenzano l'attività della luciferasi dopo 24 ore di trattamento. La seconda parte del protocollodescrive the-counter di screening necessario per discriminare i composti modulanti attività luciferasi in particolare attraverso UTR 3 '. Oltre al protocollo dettagliato e risultati rappresentativi, forniamo importanti considerazioni circa lo sviluppo del test e la validazione del colpo (s) sul bersaglio endogena. Il reporter assay gene cell-based descritto permetterà agli scienziati di identificare molecole che modulano i livelli di proteina attraverso meccanismi post-trascrizionali dipendenti da una 'UTR 3.
Introduction
Per un lungo periodo di regolazione trascrizionale dell'espressione genica è stato pensato per svolgere un importante ruolo, se non esclusivo controllo della produzione di proteine. Accumulando prove, tuttavia, indica che regolazione post-trascrizionale contribuisce tanto quanto, se non di più, regolazione trascrizionale di determinare proteina cellulare abbondanza 1,2. Controllo post-trascrizionale dell'espressione genica è molto più complesso ed elaborato di quanto non fosse in primo pensiero. In realtà, tutte le varie fasi di controllo post-trascrizionale sono emerse da disciplinare, tra cui l'elaborazione mRNA, localizzazione, fatturato, traduzione 3, nonché il nuovo descritto reversibile RNA metilazione 4. Da una serie di processi di regolazione post-trascrizionali potenzialmente interessati, il saggio di seguito descritto si concentra su quelli che coinvolgono 'regione non tradotta (3' del mRNA 3 UTR). 3 'UTR colpisce ampiamente mRNA destino principalmente attraverso specifica interazione tra RNA-binding proteins e RNA non codificanti per le sue sequenze di regolazione e / o strutture secondarie 5. Perciò, piccole molecole che modificano queste interazioni o interferiscono con a monte trasduzione del segnale sarà spostare l'equilibrio che regola la proteina abbondanza. Questo approccio terapeutico è particolarmente importante per le patologie umani per i quali esistono evidenze che dimostrano che geni malattia rilevanti sono sottoposte a regolazione post-trascrizionale, che rappresenta quindi un potenziale bersaglio per l'intervento farmacologico. Pertanto, i sistemi che consentono per lo screening dei modulatori livelli di mRNA 'attraverso l'interferenza con i meccanismi di controllo post-trascrizionale in un formato ad alta velocità possono diventare strumenti utili all'identificazione di potenziali trattamenti innovativi.
Il saggio basato su cellule gene reporter descritto consente l'identificazione di composti capaci di modulare mRNA destino attraverso meccanismi dipendenti dalla sua 3 'UTR. Si compone di diverse parti principali componenti (Figura 1) e richiede pochi passi preliminari per convalidare la fattibilità del test. Prima di tutto, il costrutto giornalista è progettato per includere UTR 3 'da un gene di interesse. Il 3 'UTR si fonde alla fine di un gene reporter luciferasi di lucciola come (Figura 1). Eventuali cambiamenti di meccanismi di controllo post-trascrizionali esercitate attraverso l'inserimento 3 'UTR altereranno la stabilità e / o l'efficienza della traduzione di questa trascrizione chimerico, causando diversi livelli luciferasi. Pertanto, le variazioni di attività luciferasica servono come misura indiretta della colpita regolazione post-trascrizionale del gene di interesse. Il secondo componente del sistema è un costrutto di controllo giornalista, un plasmide di espressione identica che esprime lo stesso gene reporter, ma non contiene alcun 3 'UTR. I due plasmidi reporter possono essere progettati in laboratorio utilizzando protocolli di biologia molecolare convenzionali o acquistati da fonti commerciali.
La selezione di una linea cellulare appropriata è fondamentale per la costruzione dosaggio. Quale linea cellulare è il modello ottimale dipende da numerosi fattori che vanno dai requisiti clinici come somiglianza massima alla patologia a questioni solo pratici come caratteristiche disponibilità, transfectability, e la crescita. È importante sottolineare che, prima di procedere si deve fare in modo che la fusione del 3 'UTR al gene reporter ha un effetto previsto sul livello di trascrizione chimerico. L'assenza di una significativa differenza di segnale luciferasi dal 3 'UTR-cuscinetto e controllo giornalista costruisce trasfettate nelle celle selezionate indicherebbe che il 3' UTR non è funzionale in questo modello cellulare, spingendo per la ricerca di quelli alternativi. Per il formato ad alta velocità, le 3 'UTR portante e controllo costrutti reporter luciferasi dovrebbero essere stabilmente integrati nella linea cellulare selezionata. Utilizzando un stabilmente integrato su transitoriamente trasfettatelinea cellulare è preferibile per diverse ragioni. Questo amplierà la scelta di un modello di cellulare, incluse le linee di cellule di difficile trasfezione, diminuire la variabilità dei dati derivanti dalle fluttuazioni di efficienza di trasfezione, abbasserà i costi. Inoltre, su cellule trasfezione transiente sono molto spesso sovraccarico di un plasmide di DNA che porta alla saturazione del sistema. In queste impostazioni un ulteriore aumento dell'espressione giornalista potrebbe essere difficile, con conseguente diminuzione della sensibilità verso i potenziali composti upregulating.
Infine, quando tutti i componenti del dosaggio sono impostati, è fondamentale prima di passare al formato high-throughput per determinare la fattibilità del test, vale a dire, se l'attività luciferasi può essere davvero up- e down-regolato specificamente tramite inserito 3 ' UTR. I migliori controlli sarebbero piccole molecole segnalati per modulare la stabilità o traducibilità dell'mRNA attraverso UTR 3 'di interesse. Se avere questi ènon è possibile, si accettano controlli surrogate imitano l'effetto desiderato. Questi potrebbero essere miRNA o RNA-binding proteins noti per esercitare i loro effetti attraverso il legame al 3 'UTR di interesse. La valutazione di tali controlli prima della proiezione principale indica non solo la funzionalità del test sviluppato, ma consente anche per la stima della sua gamma dinamica, sensibilità e prestazioni nel formato ad alta produttività.
Utilizzando il protocollo descritto abbiamo proiettato una biblioteca di 2.000 composti 6. Neuroblastoma, il tumore solido extracranico più comune dell'infanzia, è stato utilizzato come modello biologico e la 3 'UTR dell'oncogene MYCN, la cui amplificazione predice fortemente esito negativo di neuroblastoma, come gene bersaglio 7. Figura 2 ne illustra lo schema sperimentale. La proiezione è stata divisa in tre corse con la dimensione del lotto di 27 lastre proiettati in una corsa. Il lotto di 27 piatti inclusi biblioteca Spectrum CollectionPiastre n.1-n.8 + n.25 (prima esecuzione),-n.16 n.9 + n.25 (seconda manche) e n.16, n.24 + n.25 (terza pista), ciascun Piastra proiettato in triplice copia. Così, una piastra biblioteca (n.25) è stato analizzato in tutti i tre piste che rendono possibile il confronto inter-run. Il protocollo che segue descrive una singola esecuzione di 9 dischi biblioteca testati in triplice copia.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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