Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Både transkripsjons- og post-transkripsjonsregulering ha stor innvirkning på genene uttrykk. Men vanligvis er vedtatt cellebaserte screeningsanalyser fokusere på transkripsjonsregulering, idet i det vesentlige rettet mot identifisering av promotor-målsøkende molekyler. Som et resultat, er post-transkripsjonelle mekanismer som i stor grad avdekket av genekspresjon målrettet medikamentutvikling. Her beskriver vi et cellebasert assay som tar sikte på å undersøke rollen til det 3'-ikke-translatert region (3 'UTR) i modulering av skjebnen til sin mRNA, og ved å identifisere forbindelser i stand til å modifisere det. Forsøket er basert på bruk av et luciferase reporter konstruksjon inneholdende 3'-UTR av et gen av interesse stabilt integrert inn i en sykdomsrelevant cellelinje. Protokollen er delt i to deler, med en opprinnelig vekt på den primære screening med sikte på identifisering av molekyler som påvirker luciferase-aktivitet etter 24 timers behandling. Den andre del av protokollenbeskriver telleren-screening er nødvendig for å diskriminere forbindelser som modulerer luciferaseaktivitet bestemt gjennom 3 'UTR. I tillegg til den detaljerte protokollen og representative resultater, gir vi viktige betraktninger om analysen utvikling og validering av treffet (e) på den endogene målet. Den beskrevne cellebasert reporter genet analysen vil tillate forskere å identifisere molekyler moduler protein nivåer via post-transkripsjonsmekanismer avhengig av en 3 'UTR.
Introduction
I en lang periode transkripsjonen regulering av genekspresjon ble antatt å spille en viktig om ikke eksklusivt rolle i å kontrollere proteinproduksjon. Oppsamling av bevis tyder imidlertid på at post-transkripsjonell regulering bidrar like mye, om ikke mer enn, transkripsjonsregulering for å bestemme cellulær protein overflod 1,2. Post-transkripsjonen kontroll av genuttrykk er mye mer kompleks og forseggjort enn var først trodde. Faktisk har alle de forskjellige stadier av post-transkripsjonen kontroll dukket opp for å bli regulert, inkludert mRNA behandling, lokalisering, omsetning, oversettelse 3 samt den nylig beskrevet reversible RNA metylering 4. Fra en rekke post-transkripsjonelle reguleringsprosesser potensielt påvirket, beskrevet analysen nedenfor fokuserer på de som involverer mRNA 3 'ikke-translatert region (3' UTR). 3 'UTR bredt påvirker mRNA skjebne hovedsakelig via spesifikk interaksjon av RNA-bindende proteins og ikke-kodende RNA til sine regulatoriske sekvenser og / eller sekundære konstruksjoner 5. Derfor vil små molekyler som endrer disse interaksjoner eller forstyrre oppstrøms signaltransduksjonsveiene forskyve balansen som regulerer protein overflod. Denne terapeutiske tilnærmingen er av særlig betydning for humane patologier hvor det foreligger bevis som viser at sykdoms relevante gener er underkastet post-transkripsjonell regulering, som således utgjør et potensielt mål for farmakologisk intervensjon. Derfor kan systemer som åpner for screening av mRNA nivåer 'modulatorer gjennom interferens med post-transkripsjonskontrollmekanismer i en high-throughput formatet bli verdifulle verktøy i identifisering av potensielle nye behandlinger.
Den beskrevne cellebasert reportergen analysen muliggjør identifisering av forbindelser i stand til å modulere mRNA skjebne via mekanismer som er avhengige av den 3 'UTR. Den består av flere hoved components (figur 1), og krever noen innledende skritt for å validere gjennomførbarheten av analysen. Først av alt blir reporter-konstruksjonen er utformet for å omfatte 3'-UTR fra et gen av interesse. 3 'UTR er kondensert til enden av et reportergen, slik som ildflue-luciferase (figur 1). Eventuelle endringer i post-transkripsjonskontrollmekanismer som utøves gjennom satt inn 3 'UTR vil endre stabiliteten og / eller oversettelse effektiviteten av dette kimerisk avskrift, noe som resulterer i varierte luciferase nivåer. Derfor er, forandringer i luciferaseaktivitet tjene som indirekte mål på berørte post-transkripsjonell regulering av genet av interesse. Den andre komponent i systemet er en kontroll reporter konstruksjon, en identisk ekspresjonsplasmid som uttrykker det samme reportergenet, men ikke inneholder noen 3 'UTR. De to rapportør plasmider kan være utformet i laboratoriet ved hjelp av konvensjonelle molekylærbiologi protokoller eller kjøpes fra kommersielle kilder.
Utvelgelsen av en egnet cellelinje er kritisk for analysen konstruksjon. Hvilken cellelinje er den optimale modellen avhenger av mange faktorer som spenner fra kliniske krav som maksimal likhet med patologi å bare praktiske problemer som tilgjengelighet, transfectability, og vekstegenskaper. Viktigere, forut for å fortsette en bør sørge for at sammensmelting av 3 'UTR til reportergenet har en forventet effekt på nivået av det kimære transkript. Fraværet av signifikant forskjell i luciferase-signalet fra 3'-UTR-lageret og styre reporter konstruerer transient transfektert i de valgte cellene ville indikere at det 3'-UTR ikke er funksjonell i denne cellemodell, bekreftelse for leting etter alternative seg. For high-throughput-format, bør de 3 'UTR-bærende og kontroll luciferase reporter-konstruksjonene bli stabilt integrert i den valgte cellelinje. Ved hjelp av en stabilt integrert over transient transfektertcellelinje er å foretrekke av flere årsaker. Dette vil utvide valget av en cellulær modell inklusive vanskelige å transfeksjon av cellelinjer, reduserer variabiliteten i de data som følge av svingninger i transfeksjonseffektivitet, avta kostnadene. Dessuten, ved forbigående transfeksjon celler er svært ofte overbelastet med et DNA-plasmid som fører til metning av systemet. I disse innstillingene en ytterligere økning i reporter uttrykk kan være utfordrende, noe som resulterer i redusert følsomhet overfor potensielle upregulating forbindelser.
Til slutt, når alle assay-komponentene er satt opp, er det avgjørende før flytting til high-throughput-formatet for å bestemme gjennomførbarheten av analysen, dvs. hvis luciferase-aktivitet kan være faktisk opp- og ned-regulert spesielt via den innsatte 3 ' UTR. De beste kontrollene ville være små molekyler som er rapportert å modulere stabilitet eller translatability av mRNA gjennom 3 'UTR av interesse. Hvis det å ha disse erikke er mulig, er surrogat kontroller som imiterer den ønskede effekt akseptert. Disse kan være mirnas eller RNA-bindende proteiner som er kjent for å utøve sine effekter via binding til 3'-UTR av interesse. Evaluering av slike kontroller før den primære screening ikke bare indikerer funksjonaliteten til den utviklede assay, men også gir mulighet for estimering av sitt dynamiske område, følsomhet og ytelse i high-throughput-format.
Ved hjelp av den beskrevne protokollen vi vist en 2000-sammensatte bibliotek 6. Neuroblastom, den vanligste ekstrakraniell fast tumor hos spedbarn, ble anvendt som et biologisk modellen og 3 'UTR av MYCN onkogen, hvis forsterkning forut sterkt negative utfall av nevroblastom, som målgenet 7. Figur 2 beskriver den eksperimentelle oppsettet. Screeningen ble delt i tre forsøk med den satsstørrelse på 27 platene vist i ett løp. Batch av 27 plater inkludert Spectrum Collection bibliotekplater n.1-n.8 + N.25 (første løp), n.9-n.16 + N.25 (andre løp) og n.16-n.24 + N.25 (tredje løp), hver platen vist i triplikat. Dermed ble ett bibliotek plate (N.25) analyseres innen alle tre renner gjøre mulig inter-run sammenligning. Protokollen nedenfor beskriver et enkelt løp av 9 bibliotek plater testet i tre eksemplarer.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
