三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生
Summary
The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
Abstract
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Introduction
皮膚は体の最大の器官である。これは、外部環境と内部器官の間の障壁を作成します。さらに、皮膚は、流体損失、環境の影響、傷害および感染から身体を保護し、体温1を調節するのに役立つ。 、その暴露の場所に、皮膚は、多くの場合、機械的、熱的または化学的な外傷の影響を受けます。皮膚の自己修復が可能な一般的であるが、そのような感染症、酸素、および静脈充足などの複数の局所因子は、創傷治癒障害をもたらすことができる。創傷治癒はまた、肥満、アルコール依存症、喫煙、薬物療法、栄養、糖尿病などの疾患などの全身的な要因によって干渉することができます。2
（i）の炎症段階、（ii）の増殖および（iii）リモデリング段階：創傷治癒の過程は3段階に分けることができる。皮膚への損傷時には、複雑な信号カスケードは、傷の閉鎖につながる、開始します。3損傷後、創傷は出血し、血餅が形成される。線維芽細胞は、血液凝固に移動し、その後年間で改装された新しい組織と交換してください。
皮膚の修復の基礎となる生物学的プロセスの現在の理解は限られている。小動物およびブタモデルは創傷治癒を研究するために使用されてきた。しかし、これらの結果は、直接に種特異的な違いに起因するヒトに転送することができない。これらのin vivoモデルに加えて、創傷治癒のいくつかの側面は、不死化細胞株または初代細胞に基づくin vitroで単層培養物のスクラッチを介して、創傷の状況をシミュレートすることによって調べることができる4これらのスクラッチモデルは高度に標準化されているが、十分に反映していない複合体のin vivo生理学5の二次元モデルの他には、三次元のヒト皮膚同等物は、皮膚科学研究のために開発されている。これらのモデルの皮膚部分は、葛ある脱細胞化真皮、6コラーゲンハイドロゲル、7,8グリコサミノグリカン9または合成材料を含む様々な足場を使用してnerated。10これらの皮膚同等物、上皮間葉相互作用11の役割、再上皮、線維芽細胞およびケラチノサイトの間に細胞のクロストークや採用異なる成長因子の影響を研究することができる。さらに、これらのモデルは、線維芽細胞が創傷領域内に移動し、どのように走化性因子は、組織再生にどのように影響するかについての新しい知識を得るために有用である。12
創傷治癒モデル自体の唯一ではない世代は挑戦的であるだけでなく、モデル性の高い標準化された傷を確立することは問題がある。傷を作成するための一般的な技術は、スクラッチテスト、13火傷、14テープ摩耗、15熱傷、16吸引水疱、17液体窒素、18レーザー、19アール</SUP>メス、18メッシャー6と生検パンチ。20これらのメソッドのほとんどは、同じ落とし穴を持っている。手動で実装けがを標準化し、複数のテストの間で再現することが困難である。サイズ、形状、および傷の深さは、研究の間で変化するので、研究データの品質を損なう。定義された皮膚の創傷のためのレーザーの使用は、比較的容易に標準化されたが、火傷を模倣する状況をもたらすことができる。レーザーによって加えられた熱は、壊死組織につながることができ、タンパク質の変性、血小板の凝集や血管収縮を引き起こす可能性があります。
別のアプローチでは、我々は、私たちは、無菌条件下で定義されており、正確な皮膚創傷を生成することができ、自動化創傷デバイス（AWD）を、開発しました。浸透深さと速度のようなパラメータを創傷ならびにドリルヘッドの回転を規制することができる。本研究では、家の中で開発された全層皮膚等価物とAWDを組み合わせた（FTGangatirkar らによって公開プロトコルに匹敵するSE）。8皮膚同等物の真皮層は、I型コラーゲンは、ヒドロゲルに埋め込 まれたヒト皮膚線維芽細胞（HDF）、から構成されている。真皮層の上に、ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）は播種。二週間以内に、気液界面でのHEKは、いくつかの重要な細胞層からなる表皮と角質層を構築する。このモデルの生成に加えて、本研究では、FTSEで定義され、正確な傷を作成するためのAWDの使用を示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロで細胞は通常、細胞がプラスチック表面に付着した二次元細胞培養物中で増殖させる。しかしながら、これらの培養条件は、細胞が生体内で成長する生理学的三次元の条件を反映していない。三次元の条件の下では、細胞は、天然の細胞 – 細胞および細胞 – マトリックスの添付ファイルを形成することができ、三次元に遊走する。特にin vivoでの状況の類似治?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
| Skin model submers medium (500ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
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