التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس
Summary
وخارج الحي إعداد جديد لتصوير النخاع الشوكي الماوس. هذا البروتوكول يسمح لاثنين من الفوتون التصوير من التفاعلات الخلوية الحية في جميع أنحاء الحبل الشوكي.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
نماذج الماوس من إزالة الميالين، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع التجريبي المناعة الذاتية (EAE) والعدوى داخل الجمجمة مع neuroadapted فيروس التهاب الكبد الماوس (MHV)، هي أدوات ممتازة لدراسة المسارات الجزيئية والتفاعلات الخلوية المرتبطة المرض. كما أدت إلى وبدعم وافقت ادارة الاغذية والعقاقير فعالية العلاجات الدوائية، وتستهدف وقف المناعة الذاتية والتهاب 1 في المقام الأول. ومع ذلك، مرة واحدة وفشلت عودة الميالين الذاتية، والعلاجات المعتمدة حاليا لا إصلاح فعال آفات عديمة الميلين في الجهاز العصبي المركزي. لذلك، والعلاجات التي تركز على إصلاح في هذه المرحلة من المرض الحرجة للتخفيف من الأعراض المزمنة وتحسين نوعية الحياة. في الآونة الأخيرة، أصبحت خلايا العصبية السلائف (الشخصيات) الى الواجهة كطريقة علاجية التجدد المحتملة لاستهداف مناطق الالتهاب وإزالة الميالين. وقد أبرزت العديد من الدراسات قدرة اللجان التحضيرية الوطنية للحث على endogenoلنا عودة الميالين والمشاركة مباشرة في عودة الميالين 2-8. وذلك لأن وتشارك الشخصيات في عودة الميالين المباشر، لا بد من فهم حركية والتفاعلات مع الخلايا الذاتية بعد زرع. بعد زرع، الشخصيات تهاجر البطني إلى مناطق الضرر المادة البيضاء، ثم rostrally ونحو caudally النسبية الى الموقع زرع 5،9. حركية الهجرة تختلف في استجابة لمنبهات البيئية؛ الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي غير التالفة لها سرعات أكبر من الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي التالفة 6. بعد فترة المهاجرة، ونقل الشخصيات تتكاثر على نطاق واسع، بمعدل أعلى في التالفة الحبل الشوكي بالنسبة إلى الحبل الشوكي سليما 6. وأخيرا، فإن غالبية الشخصيات تفرق في قليلة التغصن والشروع 4،6،9 عودة الميالين المباشر.
الآفة عديمة الميلين معقدة ويمكن أن تشمل مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا في مراحل مختلفة منctivation. على سبيل المثال، يمكن أن تشمل على التصلب المتعدد (MS) الآفة النشطة عدد كبير من السكان من خلايا تنشيط T، الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة M1 M1، ولكن يمكن أن تتكون لالمزمنة الصامتة MS الآفة أساسا من الخلايا النجمية على رد الفعل مع عدد قليل من الخلايا الالتهابية 10-13. ونظرا لتنوع الخلايا المستجيب، واثنين من الفوتون (2P) التصوير في نماذج الماوس من إزالة الميالين هو أداة مفيدة للغاية للمساعدة في فهم التفاعلات الخلوية المحلية داخل الآفة. في MS والعديد من النماذج البحثية المستخدمة على نطاق واسع MS، والغالبية العظمى من الآفات وتقع على الجانب البطني من الحبل الشوكي، وهي منطقة يصعب الوصول إليها لتصوير حيوي داخلي 2P بسبب عمق الآفة والمحتوى الدهني المرتفع من الحبل الشوكي. للتحايل على هذه القضايا والتفاعلات دراسة خلية خلية داخل الآفات على طول الحبل الشوكي بطني قمنا بتطوير بسيط خارج الحي 2P إعداد التصوير 6.
هذه الدراسة بمتابعة أساليب نشر السابق، والذي أظهرالإجراء لزرع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) الشخصيات -expressing في الحبل الشوكي للفئران التالية JHMV سلالة من MHV التي يسببها إزالة الميالين 14. يصاب خمسة أسابيع الفئران القديمة مع JHMV وزرعها مع EGFP-الشخصيات على مستوى الصدري 9 في يوم 14 بعد الإصابة. بروتوكول المعروضة هنا يوفر الخطوات مفصلة حول كيفية استخراج النخاع الشوكي، وجعل إعداد فيفو السابقين الاغاروز، وصورة زرع EGFP-NPC التفاعلات مع تعزيز بروتين فلوري الأصفر (EYFP) محاور -expressing. واستخدمت الفئران معربا عن EYFP تحت العصبية محددة Thy1 المروج في هذا الإجراء 15. فقط بعض من محاور التعبير عن EYFP، مما يجعلها مفيدة لتصوير محاور الفردية. نحن هنا تظهر النخاع الشوكي إزالتها في 7 أيام بعد زرع؛ ومع ذلك، النخاع الشوكي يمكن استخراجه في أي نقطة زمنية بعد زرع. في حين نظهر تفاعلات الشخصيات مع محاور التالفة، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع علامات الفلورسنت الوراثيةمن أنواع الخلايا الأخرى للتحقيق في العديد من التفاعلات الخلوية التي تحدث في جميع أنحاء الحبل الشوكي الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الوقت الحقيقي هو مطلوب 2P التصوير من الأنسجة سليمة للتحقيق حركية مجلس الشعب والتفاعلات التالية زرع في النخاع الشوكي الماوس عديمة الميلين. ويستخدم حيوي داخلي 2P التصوير عادة لتحديد ديناميات الخلوية على الجانب الظهري للحبل الشوكي في الفئران الحية، واستخدمت لدراسة ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
- Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
- Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
- Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
- Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
- Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
- Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).
- McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
- Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
- Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
- Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).
