Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato
Summary
Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
Modelos de ratos de desmielinização, incluindo a encefalomielite autoimune experimental (EAE) e infecção intracraniana com neuroadapted vírus da hepatite do camundongo (MHV), são excelentes ferramentas para estudar vias moleculares e interações celulares associados à doença. Eles têm conduzido a e suportado a eficácia de terapias farmacêuticas aprovado pela FDA, principalmente contra a cessação de autoimunidade e inflamação 1. No entanto, uma vez que a remielinização endógeno falhou, as terapias actualmente aprovadas não eficaz para reparar lesões de desmielinização do sistema nervoso central. Portanto, terapias focadas no reparo nesta fase da doença são fundamentais para o alívio de sintomas crônicos e melhoria da qualidade de vida. Recentemente, as células precursoras neurais (NPCs) vieram à tona como um potencial modalidade terapêutica regenerativa para atingir áreas de inflamação e desmielinização. Vários estudos têm destacado a capacidade de NPCs para induzir endógenonos remielinização e participar diretamente remielinização 2-8. Porque NPCs estão envolvidos em remielinização direta, é imperativo compreender a sua cinética e interações com células endógenas após o transplante. Após o transplante, NPCs migrar ventralmente para áreas de lesões da substância branca, em seguida, rostral caudal e relativas ao local de transplante 5,9. A cinética da migração diferem em resposta aos estímulos ambientais; NPCs transplantadas em uma medula espinhal não danificado têm velocidades maiores que as NPCs transplantadas em uma medula espinhal danificada 6. Depois de um período migratório, transferido NPCs proliferam extensivamente, a uma taxa mais elevada num medular danificado em relação a uma medula espinhal intacta 6. Finalmente, a maioria dos NPCs diferenciar em oligodendrócitos e iniciar 4,6,9 remielinização directa.
A lesão desmielinização é complexo e pode incluir uma população diversa de células em vários estágios de umctivation. Por exemplo, uma lesão activa esclerose múltipla (EM) podem incluir uma população significativa de células T activadas, a microglia e macrófagos M1 M1, mas uma lesão crónica MS silenciosa pode ser constituída essencialmente por astrócitos reactivos com poucas células inflamatórias 10-13. Devido à diversidade de células efectoras, de dois fotões (2P) de imagem em modelos de rato de desmielinização é uma ferramenta extremamente útil para ajudar a compreender as interacções celulares locais no interior da lesão. Em muitos modelos de MS e MS de investigação amplamente utilizadas, a maioria das lesões está localizada no lado ventral da medula espinhal, uma região inacessível para imagens intravital 2P devido à profundidade da lesão e o elevado teor de lípidos da medula espinhal. Para contornar esses problemas e as interações célula-célula estudo dentro de lesões ao longo da medula espinhal ventral, temos desenvolvido um simples ex vivo 2P preparação imaging 6.
Este estudo segue-se uma publicação métodos anterior, que mostrouo procedimento para o transplante reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) NPCs -expressing para a medula espinhal de ratos após JHMV estirpe de desmielinização induzida por MHV 14. Cinco semanas ratos velhos são infectadas com JHMV e transplantados com eGFP-NPCs ao nível torácico 9 no dia 14 pós-infecção. O protocolo apresentado aqui fornece etapas detalhadas sobre como extrair a medula espinhal, fazer uma preparação ex vivo agarose, e imagem transplantado interações eGFP-NPC com melhor proteína fluorescente amarela (EYFP) axônios -expressing. Ratos que expressam EYFP sob a Thy1 promotor específico neuronal foram usados neste procedimento de 15. Apenas alguns dos axônios expressar EYFP, tornando-o útil para a imagem latente axônios individuais. Aqui nós mostramos medulas espinhais removidas em 7 dias pós-transplante; no entanto, a espinal medula pode ser extraída em qualquer momento após o transplante. Enquanto que mostram as interacções de NPCs com axónios danificados, o nosso protocolo pode ser utilizado em combinação com marcadores fluorescentes genéticosde outros tipos de células para investigar uma variedade de interacções celulares que ocorrem durante todo o rato medula espinhal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Real-time 2P imagiologia de tecido intacto é necessária para investigar a cinética da APN e interacções após o transplante para o rato demyelinated medula espinhal. Intravital 2P imagem é utilizada para determinar a dinâmica celular na face dorsal da medula espinal em ratos vivos, e tem sido utilizada para estudar a desmielinização dorsal em doenças desmielinizantes 17-19. No entanto, porque NPCs transplantadas migrar para a substância branca ventral, o qual se encontra muito profundo para imagem …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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