De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón
Summary
Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
Los modelos de ratón de desmielinización, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y la infección intracraneal con virus de la hepatitis del ratón neuroadapted (MHV), son excelentes herramientas para estudiar las vías moleculares y las interacciones celulares asociados con la enfermedad. Han liderado y apoyado la eficacia de las terapias farmacéuticas aprobado por la FDA, destinado principalmente a la cesación de la autoinmunidad y la inflamación 1. Sin embargo, una vez que la remielinización endógena ha fracasado, las terapias aprobadas actualmente no reparan efectivamente lesiones de desmielinización en el sistema nervioso central. Por lo tanto, las terapias de reparación centrada en esta etapa de la enfermedad son fundamentales para el alivio de los síntomas crónicos y mejora de la calidad de vida. Recientemente, las células precursoras neuronales (CPN) han venido a la vanguardia como una modalidad terapéutica potencial regenerativo de las zonas de inflamación y desmielinización objetivo. Varios estudios han puesto de manifiesto la capacidad de los NPCs para inducir endogenonos remielinización y participar directamente en la remielinización 2-8. Debido NPCs están involucrados en la remielinización directa, es imprescindible entender su cinética y las interacciones con las células endógenas después del trasplante. Después del trasplante, NPCs migran ventralmente a áreas de daño de la sustancia blanca, entonces rostral y caudal en relación con el sitio de trasplante de 5,9. La cinética de la migración difieren en respuesta a señales ambientales; NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada no tienen mayores velocidades que los NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada 6. Después de un período migratorio, transferidos NPC proliferan extensamente, a una tasa superior en un cable dañado la médula relativa a una médula espinal intacta 6. Por último, la mayoría de los NPC diferenciarse en oligodendrocitos e iniciar 4,6,9 remielinización directa.
La lesión desmielinizada es complejo y puede incluir una población diversa de células en diversas etapas de unactivation. Por ejemplo, una lesión activa la esclerosis múltiple (MS) puede incluir una importante población de células T activadas, microglia y macrófagos M1 M1, pero una lesión MS silenciosa crónica puede estar compuesto principalmente de los astrocitos reactivos con pocas células inflamatorias 10-13. Debido a la diversidad de las células efectoras, de dos fotones (2P) de imágenes en modelos de ratón de la desmielinización es una herramienta extremadamente útil para ayudar a entender las interacciones celulares locales dentro de la lesión. En muchos modelos de investigación MS utilizados ampliamente MS y, la mayoría de las lesiones se localizan en el lado ventral de la médula espinal, una región inaccesible para formación de imágenes 2P intravital debido a la profundidad de la lesión y el alto contenido de lípidos de la médula espinal. Para evitar estos problemas y de las interacciones célula-célula estudio dentro de las lesiones de la médula espinal ventral, hemos desarrollado un sencillo preparación imágenes in vivo 2P 6 ex.
Este estudio da seguimiento a una publicación métodos anteriores, que mostróel procedimiento para el trasplante de proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) NPC que expresaban en la médula espinal de ratones después de JHMV cepa de desmielinización inducida por MHV 14. Cinco semanas de edad ratones están infectados con JHMV y trasplantados con eGFP-NPCs a nivel torácico 9 en el día 14 después de la infección. El protocolo que aquí se presenta ofrece los pasos detallados sobre cómo extraer la médula espinal, hacer una preparación ex vivo de agarosa, y de imagen trasplantado interacciones eGFP-NPC con proteína mejorada amarillo fluorescente (eYFP) axones que expresaban. Los ratones que expresan eYFP bajo el promotor Thy1-neuronal específica se utilizaron en este procedimiento 15. Sólo algunos de los axones expresan eYFP, lo que es útil para obtener imágenes de los axones individuales. Aquí mostramos las médulas espinales retirados a los 7 días post-trasplante; sin embargo, las médulas espinales se pueden extraer en cualquier punto de tiempo después del trasplante. Mientras que mostramos interacciones de NPC con axones dañados, nuestro protocolo se puede utilizar en combinación con marcadores fluorescentes genéticosde otros tipos de células para investigar una multitud de interacciones celulares que se producen en toda la médula espinal de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
En tiempo real se requiere 2P imágenes de tejido intacto para investigar la cinética de la APN y las interacciones tras el trasplante en el ratón desmielinizada médula espinal. Intravital de imágenes 2P se utiliza comúnmente para determinar la dinámica celular en el lado dorsal de la médula espinal en ratones vivos, y ha sido utilizado para estudiar la desmielinización dorsal en enfermedad desmielinizante 17-19. Sin embargo, debido NPC trasplantados migran a la materia blanca ventral, que se encuentr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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